Введение
1 Основные группы ферментов генетической инженерии
1.1 Рестриктазы
1.1.1 Механизм действия рестриктаз
1.1.2 Построение рестрикционных карт
1.3 Лигазы
2 Введение нового гена в клетку
2.1 Регуляция экспрессии гена у прокариот
2.2 Способы прямого введения гена в клетку
2.3 Введение генов в клетки млекопитающих
2.4 Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих
2.5 Генотерапия
2.6 Получение трансгенных животных
Заключение
Список литературы
Введение
Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.
Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.
Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.
Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:
Специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;
Быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;
Конструирование рекомбинантной ДНК;
Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;
Клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;
Введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.
История генетической инженерии
Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.
На рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.
Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа. Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.
Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.
Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных.
Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.
1 Основные группы ферментов генетической инженерии
Генетическая инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты. Если с клетками и клеточными органеллами мы подчас можем работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. Что же делать? В роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания" выступают ферменты.
Только они могут найти определенные последовательности нуклеотидов, "разрезать" там молекулу или, наоборот, "заштопать" дырку в цепи ДНК. Эти ферменты издавна работают в клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК при делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача генного инженера - подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.
Следует отметить, что ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности. Это позволяет генной инженерии преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.
Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:
Ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);
Ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);
Ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
Ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.
1.1 Рестриктазы
Общепринято термины "рестриктаза", "эндонуклеаза рестрикции" и "сайт специфическая эндодезоксирибонуклеаза" считать синонимами.
Все рестрикционные эндонуклеазы бактерий узнают специфические, довольно короткие последовательности ДНК и связываются с ними. Этот процесс сопровождается разрезанием молекулы ДНК либо в самом сайте узнавания, либо в каком-то другом, что определяется типом фермента. Наряду с рестрикционной активностью бактериальный штамм обладает способностью метилировать ДНК; для этого процесса характерна такая же специфичность в отношении последовательностей ДНК, как и для рестрикции. Метилаза добавляет метильные группы к адениновым или цитозиновым остаткам в том же сайте, в котором связывается рестрикционный фермент. В результате метилирования сайт становится устойчивым к рестрикции. Следовательно, метилирование защищает ДНК от разрезания.
Различают 3 основных класса рестриктаз: 1, 2 и 3.
Все рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго определенные последовательности, но рестриктазы 1-го класса осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы 2-го и 3-го классов узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии.
Ферменты типов 1 и 3 имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей - модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной.
Ферменты второго класса состоят из 2 отдельных белков: рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы, поэтому в генной инженерии используются исключительно ферменты 2-го класса. Они нуждаются в ионах магния в качестве кофакторов.
В настоящее время выделено более 500 рестриктаз класса 2, однако среди ферментов, выделенных из различных микроорганизмов, встречаются такие, которые узнают на ДНК одни и те же последовательности. Такие пары или группы называют изошизомерами. Различают истинную изошизомерию, когда ферменты узнают одну и ту же последовательность нуклеотидов и разрывают ДНК в одних и тех же точках, и ложную, когда ферменты, узнавая один и тот же сайт на ДНК, производят разрывы в разных точках в пределах того же сайта.
Большинство рестриктаз класса 2 узнают последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, поэтому рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие. Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем последовательности из шести нуклеотидов. Например, в ДНК бактериофага Т7, состоящей из 40000 пар оснований, отсутствует последовательность, узнаваемая рестриктазой R1 из E. coli.
К мелкощепящим относятся рестриктазы Hpa II и Alu (из Arthrobacter luteus), к крупнощепящим - Eco R I (из Escherichia coli) и Hind III. Если предположить, что участки узнавания рестриктаз распределены вдоль цепи ДНК случайно, то мишень для ферментов, узнающих последовательность (сайт) из четырех нуклеотидов, должна встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а для ферментов, узнающих шесть нуклеотидов, - через 4096 пар оснований. Если сайт рестрикции окажется внутри гена, то обработка ДНК-рестриктазой приведет к его инактивации. Вероятность такого события очень велика при обработке мелкощепящими рестриктазами и незначительна при применении крупнощепящих эндонуклеаз. Поэтому с целью получения неповрежденного гена расщепление проводят поочередно несколькими крупнощепящими рестриктазами, либо применяют прием "недорестрикции", т.е. рестрикцию проводят в таких условиях, когда происходит расщепление лишь в одном сайте.
8860 0
В настоящее время известно около 40 различных способов доставки рекомбинантной ДНК в клетки, по-разному решающих проблему преодоления плазматической мембраны. Пока не существует единой классификации методов доставки рекомбинантной ДНК в клетки. Каждый автор обзоров классифицирует по-своему, возможно, потому, что для многих эмпирически найденных методов механизм преодоления мембраны не ясен до сих пор, например для трансформации. С терминологией также существует неопределенность, что неудивительно для бурно развивающейся новой области науки и практики.
Каждый из методов доставки чужеродной ДНК в клетки имеет свои особенности, преимущества и недостатки в отношении выживаемости клеток, эффективности введения, универсальности, возможностей технического осуществления. Выбор метода зависит от типа клеток-хозяев и типа использованного вектора, а также от личных предпочтений и возможностей экспериментатора. Ниже подробно рассмотрены некоторые наиболее известные способы доставки ДНК в клетки-мишени.
Трансформация в самом общем значении - это процесс введения свободной ДНК в клетку. В более узком значении термин применяется в основном по отношению к бактериям, обозначая процесс поглощения рекомбинантной ДНК компетентными клетками, индуцированный температурным фазовым переходом клеточной мембраны. E. coli является самым распространенным организмом при работе с рекомбинантными ДНК, и чтобы обеспечить внедрение в клетки плазмидной ДНК, клетки выдерживают с ледяным раствором СаС12 и ДНК, а затем подвергают тепловому шоку при 42 °С в течение ~1 мин.
По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК,
при этом составляет примерно 10000 - 10000000 . Эффективность этого метода невысока, приблизительно менее 0,1 % клеток оказываются трансформированными, но этот недостаток компенсируется применением схем отбора, позволяющих быстро идентифицировать нужные клоны.
Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными. Доля этих клеток в популяции обычно очень мала, но ее можно повысить, используя специальную питательную среду, условия культивирования и химические индукторы компетентности (подобранные, как правило, эмпирически). Часто используемый этап подготовки компетентных клеток получение сферопластов - клеток, частично или полностью (протопласты) лишенных наружной ригидной клеточной стенки.
Например, только таким способом была осуществлена эффективная трансформация многих грамположительных бактерий родов Bacillus, Listeria, Streptommyces и др. Некоторые методики трансформации дрожжей также включают стадии ферментативного удаления оболочки дрожжевой клетки с помощью глюкозидаз. Для организмов, устойчивых к химическим индукторам компетентности или не обладающих природной компетентностью, применяются другие системы доставки ДНК.
Конъюгация. Существуют бактериальные плазмиды (конъюгативные плазмиды), обладающие способностью создавать межклеточные контакты, через которые они и переходят из одной клетки в другую. Образование контактов между донорной и рецепиентной клетками обеспечивается конъюгативными свойствами плазмид, а сам перенос ДНК - мобилизационными. При этом конъюгативная плазмида может увлекать за собой обычный плазмидный вектор, находящийся в той же клетке.
Таким образом можно трансформировать клетки-реципиенты, с трудом поддающиеся трансформации другими способами. Например, показан мобилизационный перенос челночного вектора pAT187 с широким кругом хозяев из E. coli в различные грамположительные бактерии (родов Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus и др.), хотя и с намного меньшей эффективностью, чем для переноса между разными штаммами E. coli.
Более того, недавно была продемонстрирована возможность конъюгативного переноса ДНК из бактериальных клеток в культивируемые клетки животных. В процессе конъюгации переносится только одна цепь донорской плазмиды, на которой затем синтезируется вторая цепь. Это приводит к тому, что конъюгативно передаваемая плазмида не подвергается атаке хозяйских рестриктаз. Эффективность этого метода для бактерий сопоставима с трансформацией.
Вирусная инфекция. Для внедрения векторов на основе вирусов широко используется природный инфекционный путь заражения клетки-хозяина, который зависит от типа вируса.
Перфорационные методы. Одним из популярных методов введения нуклеиновых кислот в клетки-мишени является электропорация - временное создание пор в бислойной липидной мембране под кратким воздействием электрического поля. Является универсальным физическим методом трансформации, методика которого разработана практически для всех типов клеток.
При работе с E. coli подготовленную клеточную суспензию (~50 мкл) и ДНК помещают между электродами и подают единичный импульс тока длительностью ~4,5 мс при напряжении 1,8 кВ, расстояние между электродами составляет 1 мм. После такой обработки эффективность трансформации повышается до 109-1011 для малых плазмид (~3-6 тпн) и до 106 для больших (~135 тпн). Аналогичные условия используют для введения в Е. coli вектора ВАС.
Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (12-18 кВ/см), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1-2 кВ/см. Электропорация - наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки, требующий, однако, специального прибора электропоратора.
Другие перфорационные методы доставки ДНК в клетку: обработка клеток ультразвуком, соскабливание клеток с субстрата в присутствии экзогенного материала, центрифугирование клеток в среде с ДНК в сочетании с электропорацией, осмотическая перфорация плазматической мембраны, пробой клетки лазерным микролучом, использование порообразующего токсина стрептолизина-О.
Трансфекция. Первоначально этот термин обозначал введение в клетки вирусной ДНК, сейчас его значение расширилось до обозначения введения любой чужеродной ДНК в клетки эукариот. Термин «трансформация», обозначающий процесс введения ДНК в клетку для прокариот и дрожжей, оказалось, использовать неудобно, поскольку применительно к животным клеткам трансформация - это превращение нормальных клеток в раковые. В узком смысле под трансфекцией в основном понимают введение ДНК в эукариотические клетки с помощью различных химических реагентов.
Одним из первых разработанных методов эффективной трансфекции была инкубация ДНК с ДЕАЕ-декстраном. Полученная эффективность была сопоставима с трансформацией бактерий и достигала 106 трансфектантов на мкг ДНК.
Механизм действия ДЕАЕ-декстрана окончательно не установлен, но известно, что он связывается с ДНК и с клеточной мембраной, стимулируя пиноцитоз (рис. 2.8), хотя сам клетками не захватывается. К недостаткам метода стоит отнести токсичность ДЕАЕ-декстрана для некоторых типов клеток, зависимость эффективности от качества препарата, очень малую частоту получения стабильных трансфектантов.
Рис. 2.8. Схема введения ДНК в составе различных комплексов в клетку путем эндоцитоза: фагоцитоза и пиноцитоза (а). Схематичное изображение частицы из нелипидного поликатиона в дендроформе со связавшейся ДНК, отрицательный заряд которой компенсируется катионным полимером (б)
Эффективность трансфекции удалось повысить в 10-100 раз инкубацией клеток с осажденной фосфатом кальция ДНК. Плотные частицы кальциевого преципитата ДНК поглощаются клеткой путем фагоцитоза (рис. 2.8), но при этом только небольшая часть проникших молекул достигает ядра и встраивается в хромосомную ДНК. Кальций-фосфатный метод более эффективен и дешев, но вызывает разрыв молекул ДНК, что переводит кольцевые молекулы в линейную форму, иногда неинфекционную в случае трансфекции вирусов. Кроме того, условия кальций-фосфатной трансфекции приходится подбирать для каждых клеток-мишеней индивидуально.
В ходе поисков других трансфецирующих реагентов было выявлено, что полимерные молекулы, несущие избыточный катионный заряд, могут существенно повысить эффективность трансфекции. Полимерные катионы образуют с нуклеиновыми кислотами устойчивые комплексы с нейтрализованными зарядами, которые могут с высокой эффективностью транспортировать ДНК и РНК внутрь клетки, защищая от действия эндонуклеаз на пути к ядру (рис. 2.9).
Рис. 2. 9. Схема транспорта ДНК в ядро клетки в составе комплекса поликатион-ДНК, связанного со специфическим лигандом, путем лиганд-опосредованного эндоцитоза
Синтетические нелипидные полимерные катионы в линейной или разветвленной конформации (дендритная форма) могут конденсировать ДНК и РНК в относительно малые частицы, которые затем связываются с клеточной мембраной и проникают в клетку путем неспецифического эндоцитоза. В настоящее время для трансфекции из группы нелипидных поликатионов используются в основном полиэтиленимин, полиамидоамины и дендримеры на их основе, катионные белки типа полилизина, протамина и гистонов, а также различные коммерческие продукты, например PAMAM.
Революцией явилось введение в практику первого низкотоксичного катионного липида ДОТМА (1,2-диолеил-3-N,N,N-триметиламинопропан), синтезированного Фелгнером (Feigner, 1987) с соавторами. Эффективность трансфекции с использованием катионного липида (рис. 2.10) была приблизительно в 100 раз больше относительно любого другого химического реагента, причем с большой долей стабильных трансгенных клеток.
Рис. 2. 10. Структура комплекса с ДНК (а) и общая структура катионного ли-пидного полимера (б). Катионные липидные полимеры (линейные и разветвленные), похожие по своей структуре и свойствам на клеточные мембранные фосфолипиды формируют комплексы с ДНК в виде многослойных катионных липосом (а) при простом смешивании реагентов. Такие комплексы проникают в клетку путем эндоцитоза или слияния с клеточной мембраной через липидную часть
Одновременно был введен в практику новый термин «липофекция», подчеркивающий высокую эффективность генетической трансформации клеток, приближающую липид-катионные комплексы к инфекционным вирусным частицам.
Развивая успех, были разработаны многочисленные вариации этих соединений (липофектин, липофектамин, селлфектин и др.).
Параллельно разрабатывались средства доставки на основе фосфолипидных липосом, начиненных ДНК или РНК.
Маленькие сферы из искусственных мембран могут сливаться с плазматическими мембранами клеток или поглощаться эндоцитозом, высвобождая содержимое внутрь клетки. Небольшую эффективность липосомной трансфекции повысило введение в структуру липосом фосфолипидов, например, кардиолипина и фосфатидилэтаноламина, образующих наряду с бислойными мембранами также инвертированные мицеллярные структуры, известные как кубические и гексагональные фазы, способные инициировать слияние мембран.
Липосомный метод достаточно капризен и требует тщательного подбора всех условий для эффективной трансфекции конкретных клеток. Кроме того, процедура инкапсулирования, обычно обработка ультразвуком, часто повреждает крупные молекулы ДНК.
Новым этапом в развитии трансфекционных реагентов стала разработка более эффективной и адресной доставки в специфические клетки-мишени нуклеиновых кислот путем введения в структуру синтетических трансфекционных реагентов и липосом различных лигандов для связывания с мембранными белками-рецепторами. Наличие таких адресных групп (лигандов), узнаваемых клеточными рецепторами, позволяет использовать механизмы лиганд-опосредованного эндоцитоза (см. рис. 2.9).
В качестве таких лигандов используют белки и пептиды, узнаваемые рецепторами; олигосахариды, поскольку на поверхности многих животных клеток присутствуют лектины -белки-рецепторы, специфически их связывающие; полисахариды. Процессы взаимодействия с клетками таких адресных комплексов ДНК(РНК)-трансфекционный реагент имеют сходство с проникновением в клетку вирусных частиц.
В настоящее время биотехнологические фирмы предлагают широкий спектр разнообразных трансфекционных реагентов - от самых простых и дешевых до самых последних разработок, специализированных под разные типы клеток и задачи. Также интенсивно продолжается создание новых еще более эффективных трансфецирующих реагентов.
Микроинъекция - клеточная мембрана прокалывается микроиглой и раствор, содержащий ДНК, вводится в цитоплазму клетки или напрямую в ядро, если ядро достаточно большое (например, ядро яйцеклетки). Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0,1-0,5 мк и микроманипулятора. Метод очень эффективен, доля клеток со стабильной интеграцией и экспрессией инъецированных генов может достигать 50 %. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.
Баллистическая трансфекция, биобаллистика, или биолистика (бомбардировка микрочастицами), основана на обстреле клеток микросферами размером около 1 -2 мкм, покрытых ДНК. Применяются микрочастицы золота, вольфрама (иногда бывает фитотоксичен), силикона и различные синтетические наносферы. Микрочастицы, покрытые ДНК, проходят через клеточные слои и переносят генетическую конструкцию непосредственно в органеллы и ядра клеток. Созданный для этой цели «генный пистолет» (gene gun), или «генная пушка», который был разработан Д. Сенфордом (J. Sanford) в 1987 г. для введения ДНК в зерна хлебных злаков, по своему устройству сходен с пневматическим оружием (рис. 2.11).
Рис. 2.11. Введение рекомбинантной ДНК в листья растения с помощью многоразового «генного пистолета» фирмы Bio-Rad (а) и его общая схема (б). Гелиевый импульс выбрасывает микрочастицы, покрытые ДНК или РНК, из капсулы с образцом. Микрочастицы, несущие ДНК, ускоряются и фокусируются для максимального проникновения в клетки, продвигаясь по разгоночному каналу и по стволу пистолета, при этом на широком выходе поток гелия диффузно расходится в стороны. Фильтр-спейсер поддерживает оптимальную дистанцию для поражения цели с максимальным удалением гелия, чтобы свести к минимуму повреждающие воздействия на поверхность клеток
Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невелика - до 1 мм, однако при особых условиях обстрела микрочастицы могут проникать в ткань на глубину до 4-5 мм и переносить гены, например, в волокна поперечно-полосатых мышц. Баллистическая трансфекция очень эффективна даже там, где толстые клеточные стенки (дрожжи, растения) являются препятствием для многих других методов доставки, и применяется в том числе для тканей, органов и даже целых организмов. В настоящее время широко используется в генотерапии, для получения трансгенных животных и растений.
Такое разнообразие средств и методов трансфекции обусловлено различными задачам, широким спектром используемых клеток-мишеней и типов доставляемых в клетки нуклеиновых кислот, а также потребностями общества в получении все более эффективных средств доставки генетической информации в клетки, ткани и целые организмы. Особое внимание уделяется развитию трансфекционных реагентов и методов в связи с поразительными перспективами генной терапии человека, для которой необходимы адресные высокоэффективные и безопасные средства генной доставки.
Стабильное и транзиентное внедрение чужеродной ДНК в клетку. После введения рекомбинантной ДНК в эукариотическую клетку, лишь ее малая часть оказывается в ядре, поскольку ядерная мембрана является труднопреодолимым барьером для чужеродной ДНК. В ядре рекомбинантная ДНК может быть интегрирована в хромосому или некоторое время существовать во внехромосомном состоянии.
Соответственно, различают стабильную трансфекцию, когда рекомбинантные ДНК интегрируются в хромосомы клеток-реципиентов и становятся их неотъемлемой частью, а также временную, или транзиентную, трансфекцию (transient transfection), при которой молекулы рекомбинантной ДНК существуют и транскрибируются в ядрах во внехромосомном состоянии непродолжительное время. Стабильное наследование внедренной чужеродной ДНК - основное условие получения трансгенных организмов для хозяйственных целей.
Поэтому разработке методов введения ДНК в клетки, ведущих к получению большей доли стабильных трансформантов, уделяется особое внимание. Кроме того, большой процент стабильных трансформантов, также позволяет отказаться от селективных и маркерных генов, являющихся балластными при создании трансгенных организмов.
Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Одним из наиболее перспективных вариантов систем доставки генов в клетки являются полиплексы – комплексы переносимой ДНК и катионных полимеров различной природы. В данной статье описываются свойства полиплексов на основе нескольких типов катионных полимеров, их транспорт в ядра клеток-мишеней, а также один из подходов для лечения злокачественных новообразований с помощью этих конструкций.
Введение
Генная терапия – лечение наследственных, онкологических и других заболеваний путём внесения в клетки пациента необходимого генетического материала с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций [Горбунова и др., 1997]. Для доставки ДНК или РНК в клетки-мишени создаются носители (векторы) для обеспечения высокого уровня трансфекции, т.е. переноса экзогенной (чужеродной) ДНК или РНК в определённые типы клеток. Помимо этого, векторы должны обеспечивать защиту генетической информации, т.к. в условиях in vivo чужеродная ДНК нестабильна из-за быстрой деградации сывороточными нуклеазами , ферментами, расщепляющими нуклеиновые кислоты.
Типы транспортёров генетического материала
В природе существуют специализированные структуры для доставки генетической информации в клетки – вирусы. Поэтому их начали использовать в качестве транспортёров генов. В то же время использование вирусных векторов имеет целый ряд ограничений. Во-первых, это малая ёмкость переносимого генетического материала и свойственная вирусам собственная клеточная специфичность. Во-вторых, это возможность вирусов возвращения к дикому типу в результате рекомбинации при прохождении однотипной инфекции. В-третьих, белки вирусных частиц обладают высокой иммуногенностью, в результате чего повторное их введение вызывает иммунный ответ. Наконец, массовое производство вирусных векторов всё ещё достаточно проблематично и требует больших затрат. В настоящее время активно разрабатываются различные варианты невирусных носителей на основе катионных липидов и катионных полимеров. Эти катионные молекулы способны спонтанно формировать самособирающиеся нанокомплексы с отрицательно заряженной молекулой ДНК за счёт электростатических взаимодействий. Самособирающиеся комплексы, состоящие из катионных липидов и ДНК, называют липоплексами, состоящие из катионных полимеров и ДНК – полиплексами.
Катионные полимеры, используемые для создания полиплексов
Для целей генотерапии и биотехнологии предложено большое количество катионных полимеров или поликатионов. Поликатионы конденсируют ДНК в компактные нанокомплексы, обеспечивая стабильность ДНК и защиту от действия нуклеаз. В качестве ДНК-связывающих полимеров могут служить катионные белки, синтетические гомополимеры аминокислот (полилизины, полиаргинины), полисахарид хитозан, полиэтиленимин, дендримеры различного состава и другие модифицированные полимеры . Степень компактизации ДНК определяется суммарным зарядом комплекса, который, в свою очередь, зависит от отношения количества положительных групп полимеров к числу отрицательных фосфатных групп ДНК. Обычно в составе полиплексов поликатион находится в избытке, в результате чего формируются наноразмерные комплексы (от нескольких десятков до нескольких сотен нм), которые растворимы в воде и положительно заряжены (рис. 1, 2). В противном случае комплексы будут нестабильны.
Рис. 1. Схема образования полиплексов из катионных полимеров и кольцевой молекулой ДНК (плазмидой) . Рис. 2. Изображение полиплексов на подложке, полученное с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (деление шкалы 200 нм), .
Одним из первых применяемых для доставки генов поликатионов был поли-L-лизин (ПЛ, рис. 3), который благодаря своей пептидной природе является биодеградабельным, что делает его крайне удобным для использования in vivo. Часто для устранения нежелательных эффектов, связанных с высокой плотностью поверхностного заряда, применяют сополимер ПЛ с полиэтиленгликолем (ПЭГ), . В результате такой модификации уменьшается поверхностный заряд комплекса, что предотвращает неспецифическую адсорбцию отрицательно заряженных сывороточных белков крови на полиплексах, а также уменьшает цитотоксичность комплексов.
Полиэтиленимин (ПЭИ, рис. 3) считается одним из наиболее перспективных вариантов поликатионов для создания полиплексов на его основе. ПЭИ синтезируют в двух формах: линейной и разветвлённой. ПЭИ обладает большим количеством амино- и иминогрупп, способных к протонированию, в результате чего он проявляет буферные свойства при физиологических условиях. Полиплексы на основе ПЭИ отличаются более эффективной трансфекцией и защитой от действия нуклеаз по сравнению с другими поликатионами, что связано с высокой плотностью зарядов на ПЭИ и более компактным сворачиванием ДНК. Сильный положительный заряд приводит к токсичности ПЭИ, что вместе с отсутствием биологического разложения ПЭИ являются лимитирующими факторами для использования ПЭИ in vivo. С целью снижения цитотоксичности ПЭИ модификацируют с помощью полиэтиленгликоля, обладающего низкой токсичностью и высокой гидрофильностью.
Рис. 3. Катионные полимеры, используемые для создания полиплексов, и .
Другим представителем поликатионов, используемых в доставке генетической информации являются полиамидоамины (ПАМАМ, рис. 3). Эти соединения представляют собой сильноветвящиеся дендримеры. Благодаря ветвлению ПАМАМ обладают большой гибкостью, в лучшей степени компактизуют ДНК, полиплексы на их основе более стабильны, чем все остальные, . По своим свойствам имеет много общего с ПЭИ.
Хитозаны (рис. 3) представляют собой полисахариды, построенные из D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, связанных (1>4) гликозидными связями. В зависимости от молекулярного веса и степени деацетилирования хитозаны формируют стабильные комплексы различной величины с переносимой ДНК. Маленькие, или наоборот, слишком большие полимеры хитозана ведут к снижению экспрессии переносимого гена. Основным достоинством полиплексов на основе хитозана является биодеградабельность, .
На эффективность доставки полиплексов влияют многие факторы: молекулярный вес, степень разветвленности, полимеризации и тип полимера, размер частиц, ионная сила раствора, поверхностные заряды комплексов, а также условия проведения эксперимента. Оптимальный подход должен учитывать каждый из этих факторов и их влияние на свойства комплекса, поглощение клетками-мишенями комплексов, токсичность.
Существуют несколько подходов для обеспечения специфичности действия полиплексов на клетки-мишени. Один из них включает в себя адресную доставку нанокомплексов в определённые типы клеток. Этот подход связан с присоединением к полиплексам компонентов (лигандов), рецепторы к которым в большом количестве присутствуют на поверхности клеток-мишеней. В качестве специфичных лигандов используются различные белки, сахара, пептиды, антитела и т.д. Другая стратегия заключается в использовании таких транспортируемых генов, которые были бы активны только в определённых клетках, при этом доставка комплексов происходит неспецифично, то есть в любые клетки.
Проникновение полиплексов в клетки-мишени
Процесс доставки генетического материала включает два этапа: внеклеточный (путь от места введения до клеток-мишеней) и внутриклеточный (взаимодействие с клетками-мишенями, эндоцитоз, выход из эндосом, доставка в ядро). Внутриклеточные пути транспорта полиплексов представлены на рисунке 4.
Первым барьером, который необходимо преодолеть полиплексу на пути до клетки-мишени является кровь и внеклеточный матрикс. Именно поэтому необходимо подобрать такие физико-химические параметры комплекса, чтобы увеличить его стабильность, избежать неспецифических взаимодействий и возможности иммунного ответа. Во-первых, в составе полиплекса ДНК должна быть защищена от действия внеклеточных нуклеаз. Во-вторых, отрицательно заряженные белки сыворотки крови (альбумин, фибриноген, иммуноглобулины и др.), а также белки внеклеточного матрикса (коллагены) способны адсорбироваться на поверхности заряженных нанокомплексов, что ведет за собой изменение поверхностного заряда полиплексов, приводит к увеличению размера комплексов и к их агрегации. При введении полиплексов в организм они частично накапливаются в тканях и подвергаются фагоцитозу. По этим причинам часто применяют местное введение полиплексов (например, в опухоль при раке) в расчёте на их неспецифическое взаимодействие с клетками ткани.
Рис. 4. Внутриклеточные пути транспорта полиплексов, .
Полиплексы сначала адсорбируются на плазматической мембране, поглощаются путём эндоцитоза, после чего они должны покинуть эндолизосомы и пересечь ядерную оболочку для попадания в ядро. Существуют также альтернативные пути транспорта, не всегда приводящие к доставке комплексов в ядро. Помимо этого, для экспрессии переносимого гена необходима диссоциация полиплекса на катионный полимер и свободную ДНК.
Следующим этапом доставки генетического материала в клетки-мишени является их взаимодействие с плазматической мембраной и поглощение клеткой. Как было отмечено выше, связывание полиплексов с клетками в отсутствие лиганда происходит неспецифично в результате электростатического взаимодействия с отрицательно заряженной плазматической мембраной. В большинстве случаев такие полиплексы поглощаются путём неспецифического адсорбтивного эндоцитоза . При включении лиганда в состав комплекса можно добиться поглощения с помощью клатрин-зависимого рецептор-опосредованного эндоцитоза . Другие пути захвата зависят от типа клеток и включают в себя фагоцитоз и кавеолин-зависимый эндоцитоз. Одна из стратегий для улучшения доставки полиплексов в клетку включает в себя использование вирусных проникающих пептидов, таких как TAT-пептид, впервые выделенный из вируса ВИЧ-1. Использование этих последовательностей обеспечивает попадание конструкций в клетку, и доставку полиплексов в клеточное ядро.
Одним из самых важных этапов транспортного пути полиплексов является их выход из эндосом. Как известно, эндосомы представляют собой систему трубочек и пузырьков, что необходимо для сортировки поглощённых макромолекул. Сортирующие эндосомы расположены ближе к плазматической мембране . За счёт работы протонных помп в них понижается рН (около 6,5 в сортирующих эндосомах). Дальнейший транспорт может идти либо по пути рециркуляции с выбросом поглощённых молекул во внемембранное пространство, либо по литическому пути, когда происходит дальнейшее закисление среды в поздних эндосомах, и макромолекулы поступают в лизосомы. В лизосомах содержимое закисляется до рН 5, и поглощенные молекулы деградируют под действием гидролитических ферментов, которые активируются при низком рН. Продукты деградации удаляются из клетки путём экзоцитоза или переносятся в цитоплазму, где используются как строительный материал.
Считается, что полиплексы на основе ПЭИ в силу своих свойств способны выходить из эндосом благодаря так называемому эффекту «протонной губки» (proton sponge effect). Эта гипотеза основана на том, что катионные полимеры за счёт наличия непротонированных вторичных и третичных аминов создают буферный эффект, в результате чего H±АТФаза, накачивающая протоны в эндосомы, начинает работать активнее. При этом происходит накопление внутри эндосом анионов хлора. В результате из-за резкого увеличения осмотического давления происходит набухание и лизис, что позволяет полиплексам попасть в цитозоль неповреждёнными. Предложен и другой механизм выхода из эндосом для полиплексов, который заключается в дестабилизации эндосомальной мембраны из-за высокой поверхностной плотности заряда нанокомплексов . Комплексы на основе ПЛ и хитозана не вызывают эффекта «протонной губки» и в меньшей степени способны дестабилизировать мембрану эндосом, что приводит к гораздо меньшей эффективности трансфекции.
Выйдя из лизосом, полиплексы оказываются в перинуклеарном пространстве, после чего комплекс диссоциирует на свободный поликатион и ДНК. Считается, что это происходит за счёт конкуренции за катионные группы между фосфатными группами ДНК и низкомолекулярными соединениями и анионами цитоплазмы. В некоторых случаях диссоциация комплекса происходит, по-видимому, в ядре. Главным барьером на пути плазмидной ДНК в клеточное ядро служит двойная ядерная оболочка. Для доставки в ядро макромолекул в их состав включают последовательность ядерной локализации (ПЯЛ), которая в комплексе с?- и?-импортинами будет узнаваема ядерным поровым комплексом (ЯПК) и активно проникать внутрь ядра. Через ЯПК путём пассивной диффузии могут проходить только маленькие молекулы (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.
Механизмы действия терапевтических генов
После проникновения плазмиды в ядро начинается экспрессия терапевтического гена. Для придания специфичности действия полиплексам терапевтический ген в составе плазмиды ставится под контроль промотора (область гена, на которую садится РНК-полимераза перед транскрипцией), активного только в опухолевых тканях. Примерами могут служить промотор гена антиапоптозного белка сурвивина или гена фермента теломеразы. В качестве терапевтического гена может быть использован ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk), которая обладает способностью фосфорилировать антигерпесные соединения ацикловир и ганцикловир . Эти соединения вводятся в опухоль спустя некоторое время. Далее клеточные киназы (фосфорилирующие ферменты) превращают фосфорилированные ацикловир или ганцикловир в трифосфаты, которые способны включаться во вновь синтезированную ДНК во время удвоения при клеточном делении и терминировать её синтез. В результате клетки, в ядра которых попал ген тимидинкиназы, уничтожаются в присутствии этих веществ. При этом погибают именно делящиеся клетки, а не покоящиеся, которые не синтезируют ДНК и не включают ганцикловир или ацикловир. Такой механизм действия терапевтического гена можно использовать для целей генной терапии раковых опухолей, клетки которых быстро делятся.
Список литературы:
- Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. С.-Пб., «Специальная литература», 1997, с.287.
- Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery. //Nucl. Acids. Res., 1997, vol. 25, 3095–3101.
- Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. Current status of polymeric gene delivery systems. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2006, vol. 58, 467– 486.
- Pack D. W., Hoffman A. S., Pun S. and Stayton P. S. Design and development of polymers for gene delivery. // Nature Rev., Drug Discovery, 2005, vol. 4, 581.
- Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G. L. Intracellular routing of plasmid DNA during non-viral gene transfer. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2005, vol. 57, 755– 767.
- Maxfield F.R. and McGraw T.E. Endocytic Recycling. // Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 2004, vol. 5, 121–132.
- Reid R., Eng-Chung M., Eng-Chang H. and Topal M.D. Insertion and extension of acyclic, dideoxy, and ara nucleotides by herpesviridae, human alpha and human beta polymerases. // J. Biol. Chem., 1988, vol. 263, 3898–3904.
Дурыманов Михаил , студент Биологического факультета МГУ
Статья – призер научно-популярного конкурса на конференции «Ломоносов 2009» (Биологический факультет, секции «Нанобиотехнология», «Биоинженерия», «Биофизика».
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу направленной доставки ДНК в опухолевые и стволовые клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4. Представленное изобретение может быть использовано для направленной доставки генетических конструкций в стволовые и злокачественные опухолевые клетки с целью коррекции генных дефектов и предотвращения заболеваний. Способ включает подготовку носителей генетических конструкций путем включения в состав молекул носителя, представляющего собой ДНК-связывающую последовательность из восьми остатков аминокислоты лизина - КККККККК, сигнальных последовательностей. Присоединение сигнальной последовательности к ДНК-связывающей последовательности осуществляют с помощью линкерного участка из двух молекул ε-аминогексановой кислоты. После чего осуществляют формирование комплексов ДНК/носитель. Затем проводят трансфекцию in vitro. Предложенное изобретение позволяет повысить эффективность доставки гена интереса в опухолевые и стволовые клетки. 2 з.п. ф-лы, 4 ил.
Изобретение относится к генной медицине, генной терапии, биотехнологии и фармацевтике и может быть использовано для направленной доставки генетических конструкций в стволовые и злокачественные опухолевые клетки с целью коррекции генных дефектов и предотвращения заболеваний. Тканеспецифичность доставки генных конструкций обеспечивается благодаря использованию сигнальных последовательностей к рецептору CXCR4, который экспрессируется в клетках данного типа.
Генную терапию от подходов традиционной медицины отличает ее ориентированность на борьбу с причиной заболевания, а не с симптомами и последствиями. В настоящее время ведется разработка генотерапевтических подходов к лечению или профилактике широкого спектра заболеваний человека. Эти подходы могут быть применимы для терапии in vivo и ex vivo. Терапия in vivo основана на прямом введении генетических конструкций непосредственно в ткани организма. Доставка может осуществляться внутривенно с использованием аэрозольных распылителей или инъекций в определенные ткани. Генная терапия ех vivo основана на выделении специфического типа клеток из организма, введении в них "терапевтической" генной конструкции, отборе трансфецированных клеток и последующей реимплантацией пациенту.
В разрабатываемых в настоящее время подходах к доставке генетических конструкций выделяется три основных направления:
1) клонирование в составе вирусных векторов;
2) использование физических методов трансфекции;
3) использование комплексов плазмидных векторов экспрессии и молекул невирусных носителей.
Вирус-опосредованный перенос является высокоэффективным способом доставки ДНК в клетки-мишени, поскольку проникновение модифицированного вирусного вектора осуществляется аналогично процессу, происходящему в естественных условиях при переносе генома вируса в клетки хозяина. Наиболее изученными являются векторы, созданные на основе ретро-, адено-, аденоассоциированных вирусов. К достоинствам вирусов относится, прежде всего, сочетание в себе свойств вектора экспрессии и носителя, возможность специфичной доставки, способность трансфецировать делящиеся и неделящиеся клетки, возможность встраивания ДНК в хромосому для обеспечения долговременной экспрессии. Благодаря таким преимуществам данный подход до сих пор широко используется в исследованиях по доставки генов, хотя и имеет некоторые недостатки. Ретро- и аденоассоциированные вирусы имеют ограниченный размер клонированного фрагмента ДНК и риск инсерционного мутагенеза при встраивании вируса в геном хозяина. Серьезным недостатком аденовирусных векторов является ярко выраженный иммунный ответ при высоких дозах и повторных введениях аденовирусных конструкций (Walther W., Stein U. Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human disease // Drugs. - 2000. - v.60. - P.249-271, патент РФ №2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, опубл. 2005.05.20).
Инъекции конструкций "голой" (naked) плазмидной ДНК были одним из первых подходов при разработке стратегий генотерапевтического лечения. Низкая эффективность трансфекции с использованием «голой» ДНК послужила толчком к разработке новых методов доставки генетических конструкций. Изучены различные физические способы доставки ДНК в клетки организма. Наиболее популярными среди них являются метод баллистической трансфекции и электропорация, которые широко применяются для трансфекции клеток кожи и мышц. Метод баллистической трансфекции основан на проникновении в клетку ДНК, осажденной на золотых или вольфрамовых микрочастицах. Трансфекция происходит под давлением потока сжатого газа или жидкости. Метод электропорации основан на локальном изменении электрического потенциала клеточной мембраны вследствие воздействия электрическим током. Электрические импульсы приводят к образованию пор в клеточной мембране, тем самым делая ее проницаемой для биомолекул. Для преодоления низкой эффективности трансфекции голой ДНК in vivo также используют метод гидродинамического шока - внутривенное или внутриартериальное введение плазмидного вектора в растворе большого объема. Основными недостатками существующих физических методов трансфекции являются невысокая эффективность и локальность эффекта доставки ДНК. Они позволяют плазмиде преодолеть клеточную мембрану и избежать включения в эндосомы, предотвращая таким образом энзиматическую деградацию, но, как правило, не обеспечивают длительной персистенции введенных генетических конструкций (Wells D.J. Gene therapy progress and prospects: electroporation and other physical methods // Gene Ther. - 2004. - v.11, №18. - P.1363-1369; Wang S., Joshi S, Lu S. Delivery of DNA to skin by particle bombardment // Methods Mol Biol. - 2004. - v.245. - P.185-196; Herweijer H., Wolff J.A. Progress and prospects: naked DNA gene transfer and therapy // Gene therapy. - 2003. - v.10, №6. - P.453-458).
Невирусные носители являются альтернативой вирус-опосредованному переносу генетических конструкций в клетки млекопитающих. Невирусные носители легко синтезируются, легкость их модификации позволяет вносить изменения в структуру и состав молекул, тем самым совершенствуя средства доставки. При использовании невирусных носителей отсутствуют ограничения на размер доставляемого вектора экспрессии. Кроме того, они менее токсичны, в большинстве случаев не вызывают специфического иммунного ответа и более безопасны в применении in vivo no сравнению с вирусными векторами. Поэтому введение генетической конструкции, упакованной в невирусные носители, может осуществляться повторно. Исследование невирусных носителей развивается в направлении улучшения трансфецирующих свойств плазмидной ДНК путем образования комплексов ДНК с различными синтетическими соединениями (липидами, олиго- и полипептидами, полимерами и др.) (например, патент РФ №2336090, А61К 39/00, A61K 47/00, опубл. 2008.10.20). Совершенствование невирусных средств доставки во многом зависит от детального понимания барьеров на пути проникновения ДНК в клетки организма (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update // Trends Mol Med. - 2003. - v.9, №2. - P.67-72; Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turna J., Celec P. Vectors and delivery systems in gene therapy // Med Sci Monit. - 2005. - v.11, №4. - P.110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Barriers to nonviral gene delivery // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, №2. - P.203-217).
Считается, что невирусный носитель должен обладать следующими характеристиками:
1) быть нетоксичными, компактизовать и защищать плазмидную ДНК от ферментативной деградации, выводиться из организма после использования;
2) обеспечивать проникновение плазмиды в клетку путем специфического связывания с плазматической мембраной клетки:
3) обладать способностью к высвобождению ДНК из эндосомального компартмента;
обеспечивать диссоциацию ДНК из комплекса для последующего транспорта плазмиды в ядро.
Для целей генотерапии наиболее предпочтительным способом доставки генетических конструкций является их тканеспецифичный перенос в клетки и ткани организма.
Первым барьером на пути внутриклеточного проникновения комплексов является плазматическая мембрана. Большинство комплексов взаимодействуют с поверхностью клетки с помощью электростатических сил. Возможным механизмом связывания комплексов с клеткой является их взаимодействие с белками клеточной поверхности - гликозаминогликанами. Однако при данном механизме проникновения комплексов отсутствует тканеспецифичный перенос генных конструкций. В то же время проблема тканеспецифичной доставки генетических конструкций актуальна для генной терапии целого ряда заболеваний. Для специфического взаимодействия с клеточной поверхностью в состав комплексов включают лиганды к рецепторам на поверхности клеток. В настоящее время охарактеризован ряд пептидных лигандов интегринов. К ним относится, в частности, трипептидный фрагмент RGD (интегрины присутствуют на поверхности многих клеток), трансферрин (его рецептор обладает повышенной экспрессией в пролиферирующих клетках), асиалоорозомукоид (асиалогликопротеиновый рецептор имеет специфическую экспрессию в гепатоцитах печени).
Для специфической доставки генетического материала в нервные клетки Зенг с коллегами предложили использовать носитель, состоящий из сигнального участка к рецептору TrkA (80-108 аминокислоты из фактора роста нервов) и ДНК-связывающей последовательности из 10 остатков аминокислоты лизина. Данный носитель в присутствии эндосомолитического агента хлороквина, способствующего выходу комплексов из эндосомального компартмента клетки, был способен тканеспецифично доставлять маркерный ген только в клетки с экспрессией рецептора TrkA. Данный носитель можно применять для генотерапевтического лечения различных неврологических заболевания, таких как эпилепсия, болезни Паркинсона и Альцгеймера. Однако он не пригоден для доставки генетического материала в другие типы клеток (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S A synthetic peptide containing loop 4 of nerve growth factor for targeted gene delivery // J Gene Med 2004; 6: 1247-1256).
Стволовые клетки человека рассматриваются в качестве перспективных агентов для клеточной и генной терапии различных заболеваний человека. В то же время они относятся к одним из наиболее трудно трансфецируемых типов клеток. При генотерапевтическом лечении раковых заболеваний необходимо обеспечить доставку генов непосредственно в опухолевые клетки.
CXCR4 является рецептором фактора миграции стволовых клеток хемокина SDF-1α. CXCR4 экспрессируется в гематопоэтических клетках, эндотелии сосудов, мышечных сателлитных клетках. Отмечен высокий уровень экспрессии данного гена в более чем 20 видах раковых опухолей (рак груди, простаты и др.), а также в мигрирующих стволовых клетках. Рецептор CXCR4 также способен связываться с вирусным хемокином vMIP-II (вирус саркомы Капоши). Таким образом, включение в состав молекул носителя сигнальных последовательностей для связывания с рецептором CXCR4 является перспективным путем создания систем целевой доставки генов в опухолевые и стволовые клетки.
Для доставки генетического материала в клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, Ле Бон с коллегами использовали синтетический лиганд к данному рецептору - AMD3100, который был соединен с полиэтиленимином или катионными липидами. Комплексы генетического материала с данными соединениями не приводили к достоверному повышению эффективности доставки маркерного гена в CXCR4+ клетки по сравнению с соединениями без сигналов. Носители, применяемые Ле Боном, не были эффективными, потому что специфическая доставка с их помощью возможна только при добавлении в среду трансфекции вещества, способствующего интернализации рецептора CXCR4 (форболовый эфир). (Le Bon В, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 Conjugates as Components of Targeted Nonviral Gene Delivery Systems: Synthesis and in Vitro Transfection Efficiency of CXCR4-Expressing Cells. // Bioconjugate Chem 2004, 15: 413-423).
Таким образом, существует необходимость в создании носителя генетических конструкций, способного обеспечить специфическую доставку в CXCR4(+) клетки и не оказывать влияния на близлежащие ткани. Такой способ обеспечивается настоящим изобретением.
В основу изобретения положена задача разработки способа специфической доставки генетических конструкций в клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, в котором за счет использования носителей генетических конструкций, содержащих в своем составе сигнальные последовательности к рецептору CXCR4, достигают повышения эффективности доставки гена "интереса". Важно отметить, что синтез заявляемых носителей может быть осуществлен с помощью любого из известных методов твердофазного пептидного синтеза.
Решение поставленной технической задачи обеспечивается тем, что в способе направленной доставки ДНК в опухолевые и стволовые клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, включающем подготовку носителей генетических конструкций путем включения в состав молекул носителя, представляющего собой ДНК-связывающую последовательность из восьми остатков аминокислоты лизина - KKKKKKKK, сигнальных последовательностей, формирование комплексов ДНК/носитель, проведение трансфекции in vitro, сигнальную последовательность выбирают из группы: фрагмент с 1 по 8 аминокислоту последовательности N-конца белка SDF-1α - KPVSLSYR; фрагмент с 1 по 17 аминокислоту последовательности N-конца белка SDF-1α - KPVSLSYRCPCRFFESH, где 9 и 11 аминокислоты заменены на серин; или фрагмент с 1 по 10 аминокислоту N-терминальной последовательности вирусного хемокина vMIP-II - LGASWHRPDK; присоединение сигнальной последовательности к ДНК-связывающей последовательности осуществляют с помощью линкерного участка из двух молекул ε-аминогексановой кислоты.
При этом сигнальная последовательность может представлять собой фрагмент с 1 по 8 аминокислоту последовательности N-конца белка SDF-1α-KPVSLSYR.
Либо сигнальная последовательность может представлять собой фрагмент с 1 по 17 аминокислоту последовательности N-конца белка SDF-1α - KPVSLSYRCPCRFFESH, где 9 и 11 аминокислоты заменены на серин.
В качестве сигнального участка также может быть использован фрагмент с 1 по 10 аминокислоту N-терминальной последовательности вирусного хемокина vMIP-II - LGASWHRPDK, синтезированный из D-аминокислот.
В качестве компонента, обеспечивающего выход из эндосом комплексов, состоящих из носителей и генетического материала, может быть использован глицерин или хлороквин.
В качестве генетического материала для носителей может быть использована плазмидная ДНК.
Указанный технический результат в предлагаемом изобретении достигается за счет использования в качестве носителя молекул олиголизина - КККККККК (К8), конъюгированных с сигнальными последовательностями к рецептору CXCR4 из белков SDF-1 или vMIP-II, а именно N-концевую последовательность хемокина SDF-1 (с 1 по 8 аа) либо N-концевую последовательность хемокина SDF-1 (с 1 по 17 аа, с заменой 9 и 11 аа на серин) или N-концевую последовательность вирусного хемокина vMIP-II (с 1 по 10 аа в D-конформации). Наличие олиголизина КККККККК в составе носителя позволяет конъюгатам образовывать комплексы с нуклеиновыми кислотами, в частности с плазмидной ДНК, за счет электростатического взаимодействия.
Указанный технический результат достигается тремя вариантами заявляемого носителя.
Указанный технический результат по первому варианту достигается тем, что в носителе short CDP на основе синтетических аналогов хемокина SDF-1, включающем катионную составляющую, представляющую собой олиголизин К8, используемый для конденсации плазмидной ДНК, и лигандную составляющую для взаимодействия с рецептором CXCR4, в соответствии с заявленным изобретением в качестве лигандной составляющей используют фрагмент (1-8 аа) последовательности N-конца белка SDF-1, имеющий структуру KPVSLSYR и обладающий активностью агонистов рецептора CXCR4, а катионная составляющая конъюгата имеет структуру KKKKKKKK и присоединена к лигандной составляющей через спейсер - две молекулы ε-аминогексановой кислоты (Ahx).
Указанный технический результат по второму варианту достигается тем, что в носителе (long CDP) на основе синтетических аналогов хемокина SDF-1, включающем катионную составляющую, представляющую собой олиголизин К8, используемый для конденсации плазмидной ДНК, и лигандную составляющую для взаимодействия с рецептором CXCR4, в соответствии с заявленным изобретением в качестве лигандной составляющей используют фрагмент (1-17 аа; аа9 и аа11 заменены на серин) последовательности N-конца белка SDF-1, имеющий структуру KPVSLSYRSPSRFFESH и обладающий активностью агонистов рецептора CXCR4, а катионная составляющая конъюгата имеет структуру KKKKKKKK и присоединена к лигандной составляющей через спейсер - две молекулы ε-аминогексановой кислоты.
Указанный технический результат по третьему варианту достигается тем, что в носителе (viral CDP) на основе синтетических аналогов белка вируса саркомы Капоши vMIP-II, включающем катионную составляющую, представляющую собой олиголизин К8, используемый для конденсации плазмидной ДНК, и лигандную составляющую для взаимодействия с рецептором CXCR4, в соответствии с заявленным изобретением в качестве лигандной составляющей используют фрагмент (1-10 Daa - синтезированный из D-аминокислот) последовательности N-конца белка vMIP-II, имеющий структуру LGASWHRPDK и обладающий активностью антагонистов рецептора CXCR4, а катионная составляющая конъюгата имеет структуру КККККККК и присоединена к лигандной составляющей через спейсер - две молекулы ε-аминогексановой кислоты.
Все три варианта заявляемого носителя могут быть синтезированы с помощью известных методов пептидного синтеза, например твердофазным Вос-методом (Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide // Journal of the American Chemical Society. 1963. V.85 (14), pp.2149-2154).
Примеры конкретной реализации
Изобретение поясняется с помощью фиг.1, на которой показано изменение интенсивности флуоресценции бромистого этидия при увеличении зарядовых соотношений носитель/ДНК в комплексах short CDP/ДНК, long CDP/ДНК и viral CDP/ДНК. Падение интенсивности флуоресценции свидетельствует о возрастании плотности формировавшихся комплексов. Выход кривых флюоресценции на плато указывает на то, что комплексы достигли плотности, достаточной для гашения флуоресценции бромистого этидия.
На фиг.2 приведена зависимость активности люциферазы в клетках HeLa (CXCR4+) после трансфекции комплексами short CDP/ДНК, long CDP/ДНК и viral CDP/ДНК в присутствии эндосомолитического агента глицерина. В этом случае использовали комплексы, сформированные при следующих зарядовых соотношениях носитель/ДНК: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. В качестве контролей эксперимента служили интактная молекула, ДНК, комплексы ПЭИ/ДНК 1/8 (положительный контроль эксперимента - коммерческий носитель разветвленный полиэтиленимин 25 кДа - ПЭИ) и комплексы, содержащие ДНК и контрольный пептид (СР). СР отличается от носителей в настоящем изобретении отсутствием сигнала связывания с рецептором CXCR4 и по структуре представляет собой олиголизин КККККККК. Эффективность доставки маркерного гена носителями short CDP, long CDP и viral CDP была в 10-100 раз выше, чем контролем СР.
На фиг.3 приведена зависимость активности люциферазы в клетках А172 (CXCR4+) после трансфекции комплексами short CDP/ДНК, long CDP/ДНК и viral CDP/ДНК в присутствии эндосомолитического агента глицерина. Здесь использованы комплексы, сформированные при следующих зарядовых соотношениях носитель/ДНК: 9/1, 12/1. В качестве контролей эксперимента служили интактная молекула ДНК, комплексы ПЭИ/ДНК 1/8 и комплексы, содержащие ДНК и пептид СР. Эффективность доставки маркерного гена носителями short CDP, long CDP и viral CDP была в 10 раз выше, чем контролем СР.
Результаты на фиг.2 и фиг.3 свидетельствуют в пользу специфичности носителей в настоящем изобретении к рецептору CXCR4.
На фиг.4 показана зависимость активности люциферазы в клетках СНО (CXCR4-) после трансфекции комплексами short CDP/ДНК, long CDP/ДНК и viral CDP/ДНК в присутствии эндосомолитического агента глицерина. Использованы комплексы, сформированные при следующих зарядовых соотношениях носитель/ДНК: 9/1, 12/1. В качестве контролей эксперимента служили интактная молекула ДНК, комплексы ПЭИ/ДНК 1/8 и комплексы, содержащие ДНК и пептид СР. Эффективность доставки маркерного гена носителями short CDP, long CDP и viral CDP была практически такой же, как с использованием контроля СР.
Носители с сигналом не способны обеспечить достоверно высокого по сравнению с контролем уровня доставки генетического материала в клетках без экспрессии рецептора.
Осуществление изобретения можно пояснить следующим образом. Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении направленной доставки генетических конструкций в клетки с экспрессией рецептора CXCR4 с использованием носителей генетического материала, содержащих сигнальные последовательности к данному рецептору.
На первом этапе проводят образование комплексов одного из воплощений носителя с генетической конструкцией, содержащей ген "интереса". Сформированные комплексы используют для доставки генетического материала в соответствующие клетки-мишени. Анализ эффективности проникновения в клетки оценивают с помощью ферментативных или иммуногистохимических методов.
Формирование комплексов проводят в изотоническом растворе. Предпочтительным является бессолевой буфер НВМ (Hepes-buffered mannitol). Размер образующихся комплексов составляет 170-230 нм.
В качестве генетических конструкций в одном из воплощений используют плазмидную ДНК.
Плазмидная ДНК содержит в своем составе маркерный (luc, lacZ) или терапевтический ген (в зависимости от заболевания), под контролем соответствующих промоторов и энхансеров (CMV, SV40 и др.) и другие элементы, необходимые, например, для репликации в клетки-хозяине или интеграции в геном. При генотерапевтичеком лечении раковых заболеваний могут быть использованы гены HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, тимидинкиназы и проч.
В другом воплощении в качестве генетической конструкции используют олигонуклеотиды, состоящие из ДНК или РНК небольшого размера, комплементарные специфической последовательности в составе мРНК или ее предшественника для подавления синтеза белкового продукта или выбрасывания из мРНК экзона, несущего мутацию. Сформированные комплексы используют для доставки генетического материала в клетки с экспрессией рецептора CXCR4. Проникновение комплексов с носителем из настоящего изобретения происходит преимущественно с помощью рецептор-опосредованного переноса путем связывания с внеклеточными доменами рецептора CXCR4 и последующей интернализацией рецептора.
Доза носителей и генетического материала определяется индивидуально и зависит от типа клеток, количества рецептора CXCR4 на их поверхности и сложности трансфецирования данных клеток.
Для увеличения эффективности данных носителей трансфекцию клеток предпочтительно проводить с использованием эндосомолитического агента. К ним относятся глицерин, хлороквин и др. Данные вещества добавляют в среду трансфекции непосредственно перед внесением комплексов к клеткам. Они остаются несвязанными с комплексами, поэтому не влияют на их структуру.
В качестве ДНК-связывающей части носителя могут быть использованы пептиды, другие полимерные соединения, липосомы, которые способны к компактизации нуклеиновых кислот. Кроме того, они могут обладать эндосомолитическими свойствами (нет надобности в использовании дополнительного эндосомолитического агента) и в случае, когда это необходимо (например, для доставки терапевтических или маркерных генов), доставлять генетический материал в ядро.
При подборе условий трансфекции они создаются так, чтобы обеспечить наибольшую эффективность доставки. Предпочтительным является инкубация комплексов с клетками в течение 4 часов. Однако можно варьировать это время от 3 до 6 часов. По истечении времени инкубации производят смену среды и оставляют клетки на 24-48 часов (в зависимости от типа клеток и генетического материала) для экспрессии введенных конструкций с геном-интереса или проявления терапевтического эффекта олигонуклеотидов.
Анализ эффективности доставки проводится ферментативными или иммуногистохимическими методами в зависимости от типа введенной генной конструкции.
Пример 1. Формирование комплексов ДНК/носитель и изучение процесса комплексообразования.
В качестве генетического материала для направленной доставки генов в клетки была использована плазмида pCLUC4, содержащая ген люциферазы светляков под контролем промотора цитомегаловируса. Использовали одно из воплощений носителя.
Приготавливали растворы 1 мкг ДНК в 40 мкл 1X буфера НВМ (5% w/v mannitol, 5 mM Hepes, pH 7.5) и растворы носителя, соответствующие различным зарядовым соотношениям ДНК/носитель, в равном объеме буфера. В пробирку-эппендорф с раствором ДНК постепенно добавляли раствор носителя и интенсивно перемешивали в течение 20 секунд. Полученную смесь оставляли на 30 минут при комнатной температуре для завершения процесса формирования комплексов.
Результаты по комплексообразованию анализируют методом вытеснения бромистого этидия. Измерение флуоресценции этидиум бромида производят с помощью спектрального сканирующего мультирежимного считывающего устройства Varioscan Flash (Thermo, Finland). Наблюдается вытеснение бромистого этидия при излучении 590 нм (возбуждение при 544 нм) после добавления носителя к ДНК (20 мкг/мл), преинкубированной с интеркалирующим агентом бромистым этидием (400 ng/ml). Вытеснение было посчитано по формуле (F-Ff)/(Fb-Ff), где Ff и Fb - это интенсивности флюоресценции бромистого этидия в отсутствие и присутствии ДНК соответственно Результаты представлены на фиг.1.
Пример 2. Проведение трансфекции in vitro.
Клетки культуры HeLa, A172 и СНО рассевали на культуральные 48-луночные планшеты (Nunc) за 24 часа до трансфекции из расчета 50000 клеток на лунку, содержащую 500 мкл стандартной культуральной смеси, состоящей из культуральной среды DMEM (GIBCO), 10% сыворотки эмбрионов коров (GIBCO), 2 мМ глютамина, с добавлением пенициллина (50 U/мл), стрептомицина (50 мкг/мл) и 1 мМ содиум пирувата. Суспензию комплексов приготавливали согласно методике, описанной в примере 1 из расчета 2 мкг ДНК на каждую лунку культурального планшета. За 10 минут до внесения суспензии комплексов ДНК/носитель клетки несколько раз промывали средой DMEM и вносили в каждую лунку по 500 мкл среды, содержащей 15% глицерин и 1,5% этанол. Трансфекцию проводили путем добавления суспензии комплексов ДНК/носитель в среду. После внесения комплексов планшеты с клетками помещали в термостат с температурой 37°С и 5% содержанием CO 2 на 4 часа. По прошествии времени инкубации клетки промывали средой DMEM и вносили в каждую лунку по 500 мкл стандартной культуральной смеси. Культуральный планшет инкубировали в термостате при температуре 37°С и 5% содержанием СО 2 в течение 48 часов, после чего проводили выявление экспрессии маркерного гена.
Пример 3. Выявление экспрессии гена люциферазы после трансфекции in vitro.
Удаляли среду из культуральных планшетов, промывали клетки в 1х PBS (рН 7.2). В каждую лунку добавляли по 80 мкл лизис буфера (25 MM Gly-Gly, 15 мМ MgSO 4 , 4 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF; pH 7.8). По 50 мкл лизата переносили в полистироловые планшеты с непрозрачными стенками для измерения активности люциферазы. Измерение проводили с помощью спектрального сканирующего мультирежимного считывающего устройства Varioscan Flash (Thermo, Finland). Измерение проводили с использованием раствора luciferase flash mix (20 мМ Tricine, 1.07 мМ (MgCO 3) 4 Mg(OH) 2 × 5 H 2 O, 2.67 мМ MgSO 4 , 0 1 мМ EDTA, 33.3 мМ DTT, 530 мкМ АТР, 270 мкМ ацетил коэнзима А, 470 мкМ люциферина). Каждое измерение выполнялось в течение 10 секунд. Показания прибора получали в относительных световых единицах (RLU). Результаты эксперимента оценивали в относительных световых единицах на 1 мг тотального белка из клеточных экстрактов в лунке культурального планшета. Общее количество белка в каждой лунке измеряли с помощью protein assay kit (Bio-Rad), относительно калибровочной кривой по бычьему сывороточному альбумину. Результаты представлены на фиг.2, 3, 4.
Как показывают многочисленные исследования, использование различных вирусов является весьма эффективным решением, которое позволяет пробраться через имунную защиту организма , а затем инфицировать клетки, используя их для распространения вируса. Для осуществления данной процедуры, генные инженеры выбрали наиболее подходящие вирусы из группы ретровирусов и аденовирусов. Ретровирусы привносят генетическую информацию в виде рибонуклеиновой кислоты (РНК), молекулы, похожей на молекулу ДНК, которая помогает перерабатывать генетическую информацию, сохраненную в ДНК. Как только удается проникнуть вглубь так называемой клетки-мишени, из молекулы РНК получается копия молекулы ДНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией. Как только новая молекула ДНК оказывается присоединенной к клетке, все новые копии клеток будут содержать этот модифицированный ген.
Аденовирусы несут генетическую информацию сразу в виде ДНК, который доставляется в неделящуюся клетку. Хотя эти вирусы доставляют ДНК непосредственно в ядро клетки-мишени , ДНК не совмещается с геномом клетки. Таким образом, модифицированный ген и генетическая информация не передаются дочерним клеткам. Преимуществом генной терапии, проводимой с помощью аденовирусов, заключается в том, что существует возможность введения генов в клетки нервной системы и в слизистую оболочку дыхательных путей, опять же, посредством вектора. Кроме того, существует и третий метод генной терапии, осуществляемый посредством так называемых аденоассоциированных вирусов. Эти вирусы содержат относительно небольшое количество генетической информации , и их гораздо сложнее вывести, чем ретровирусы и аденовирусы. Однако преимущество аденоассоциированных вирусов заключается в том, что они не вызывают реакции иммунной системы человека.
Генеалогический метод антропогенетики
В основе этого метода лежит составление и анализ родословных. Этот метод широко применяют с древних времен и до наших дней в коневодстве, селекции ценных линий крупного рогатого скота и свиней, при получении чистопородных собак, а также при выведении новых пород пушных животных.
Как метод изучения генетики человека генеалогический метод стали применять только с начала XX столетия, когда выяснилось, что анализ родословных, в которых прослеживается передача из поколения в поколение какого-то признака (заболевания), может заменить собой фактически неприменимый в отношении человека гибридологический метод.
При составлении родословных исходным является человек - пробанд, родословную которого изучают. Обычно это или больной, или носитель определенного признака, наследование которого необходимо изучить. При составлении родословных таблиц используют условные обозначения, предложенные Г. Юстом в 1931 г. (рис. 6.24). Поколения обозначают римскими цифрами, индивидов в данном поколении - арабскими.
С помощью генеалогического метода может быть установлена наследственная обусловленность изучаемого признака, а также тип его наследования (аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный, X-сцепленный доминантный или рецессивный, Y-сцепленный). При анализе родословных по нескольким признакам может быть выявлен сцепленный характер их наследования, что используют при составлении хромосомных карт. Этот метод позволяет изучать интенсивность мутационного процесса, оценить экспрессивность и пенетрантность аллеля. Он широко используется в медико-генетическом консультировании для прогнозирования потомства. Однако необходимо отметить, что генеалогический анализ существенно осложняется при малодетности семей.
