Nella maggior parte dei metodi terapia genetica Ex vivo e in vivo, i costrutti genetici clonati vengono utilizzati per sostituire la forma funzionale di una proteina che non è sintetizzata nel corpo del paziente o è sintetizzata in una forma difettosa. Tuttavia, molte malattie umane (cancro, infiammazioni, infezioni virali e parassitarie) sono invece associate all’iperproduzione proteine ​​normali. Sono stati sviluppati farmaci terapeutici per trattare tali condizioni.

sistemi che utilizzano oligonucleotidi specifici. Un oligonucleotide così piccolo può ibridarsi con un gene o mRNA specifico e ridurre il livello di trascrizione o traduzione, riducendo così la quantità di proteina sintetizzata responsabile della patologia. Un oligonucleotide che si ibrida con il gene stesso e ne blocca la trascrizione è detto “antigenico”, mentre quello che si ibrida con il corrispondente mRNA è detto “antisenso” (RNA antisenso). Per impedire l'attivazione della trascrizione di geni specifici, è anche possibile utilizzare oligonucleotidi a doppio filamento che si legano specificamente alle proteine ​​che legano il DNA (proteine ​​attivatrici). Infine, per ridurre la quantità di uno specifico mRNA e della proteina sintetizzata su di esso, è possibile utilizzare i ribozimi, sequenze di RNA naturali che si legano a specifiche molecole di RNA e le tagliano.

In futuro, probabilmente i farmaci a base di acidi nucleici troveranno ampia applicazione, con l'oggetto principale ricerca scientifica E test clinici ci saranno vari oligonucleotidi "antisenso".

3.1.. Oligonucleotidi “antisenso” come farmaci

L'RNA antisenso, che dovrebbe essere usato come farmaco, è un oligonucleotide corto (15-20 nucleotidi) che può legarsi a una regione specifica dell'mRNA complementare ad esso e inibire la traduzione della proteina che codifica, sopprimendo così processo patologico(Fig. 2).

L'effetto terapeutico degli oligonucleotidi sintetici "antisenso" dipende dalla specificità della loro ibridazione con il sito accessibile dell'mRNA bersaglio, dalla resistenza all'azione delle nucleasi cellulari e dalla presenza di un sistema di rilascio nella cellula. 15-20 sequenze nucleotidiche si ibridano con mRNA unici con specificità piuttosto elevata. I potenziali siti bersaglio vengono identificati testando una serie di oligonucleotidi “antisenso” utilizzando una coltura di cellule che sintetizzano l'mRNA bersaglio. Per fare ciò, viene effettuata la separazione elettroforetica delle proteine ​​cellulari, in cui durante la traduzione viene inclusa un'etichetta radioattiva e mediante autoradiografia viene determinato in presenza di quale degli oligonucleotidi “antisenso” la sintesi di una particolare proteina viene ridotta. Non esistono criteri generali per selezionare i migliori siti bersaglio nei diversi trascritti di RNA. Possono essere efficaci oligonucleotidi complementari alle estremità da 5" o 3" dell'mRNA, ai confini dell'esone e dell'introne e persino alle regioni a doppio filamento. Gli oligonucleotidi antisenso possono essere distrutti dalle nucleasi intracellulari, quindi è importante proteggerli dall'azione di queste ultime affinché non perdano la capacità di ibridarsi con il bersaglio. Per fare ciò, le basi pirimidiniche, ribosio o desossiribosio possono essere modificate in un certo modo (Fig. 3). Pertanto, negli oligonucleotidi “antisenso” attualmente più utilizzati, l’atomo di ossigeno libero del legame fosfodiestere è sostituito da un gruppo SH (Fig. 3B ), con conseguente formazione di un legame tiofosfato. Gli oligonucleotidi così modificati si dissolvono in acqua, portano una carica negativa e non vengono scissi dalle endonucleasi. Quando ibridati su un sito bersaglio, formano duplex che attivano la ribonucleasi (RNasi), un enzima endogeno che scinde l'mRNA in tale molecola ibrida. Sono stati condotti i primi studi clinici su tali oligonucleotidi, farmaci di “prima generazione”. Gli obiettivi sono l'RNA del citomegalovirus, il virus dell'immunodeficienza umana, nonché l'mRNA dei geni responsabili dello sviluppo del cancro, delle malattie intestinali e di altre malattie.

Sono stati sintetizzati oligonucleotidi “antisenso” con legami fosforamiditici e poliammidici (peptidici) - acidi nucleici peptidici (PNA) (Fig. 3 B e D ). Tali molecole sono molto resistenti alle nucleasi. I gruppi chimici attaccati all'atomo di carbonio da 2" del residuo di zucchero e all'atomo C-5 delle pirimidine proteggono anche gli oligonucleotidi antisenso e facilitano il loro legame al sito bersaglio (Fig. 3 2D E E ). Tutti i vantaggi di queste e altre modifiche vengono ora studiati intensamente.

La penetrazione degli oligonucleotidi “antisenso” nella cellula può essere notevolmente facilitata inserendoli nei liposomi. Questo sistema di rilascio altamente efficiente consente l'uso di oligonucleotidi antisenso a basse concentrazioni. Se i liposomi vengono coniugati con anticorpi specifici per gli epitopi di determinate cellule di determinati organi, sarà possibile effettuare il rilascio mirato di oligonucleotidi “antisenso”.

Studi preclinici hanno dimostrato che gli oligonucleotidi “antisenso” sono farmaci molto efficaci. È stata studiata la possibilità del loro utilizzo per il trattamento della stenosi delle arterie coronarie e carotidi, che porta ad infarti e ictus. In questi casi si ricorre spesso all'angioplastica, dilatando le arterie mediante catetere a palloncino, ma in circa il 40% dei pazienti la stenosi si ripresenta dopo 6 mesi, poiché l'angioplastica stimola la proliferazione delle cellule muscolari lisce e la secrezione di sostanza intercellulare all'interno strato dell'arteria nel sito della sua dilatazione. In uno degli esperimenti in arterie carotidi ai ratti dopo angioplastica sono stati iniettati oligonucleotidi antisenso con legami tiofosfato, complementari agli mRNA che codificano per proteine ​​importanti per il ciclo cellulare dei mammiferi; di conseguenza, il tasso di restenosi è diminuito del 90%. La proliferazione delle cellule muscolari lisce si verifica anche nell'aterosclerosi, diabete mellito, complicazioni dopo intervento di bypass coronarico. È probabile che tutte queste condizioni possano essere controllate in modi simili.

Per il trattamento possono essere utilizzati anche oligonucleotidi "Antisol". infezione virale e malaria. Inoltre, i risultati di uno studio clinico di fase I per il trattamento della malattia di Crohn utilizzando la somministrazione orale di un oligonucleotide antisenso hanno illustrato un chiaro effetto terapeutico senza evidente effetti collaterali. In questo caso, l'mRNA bersaglio codificava l'adesione intercellulare di tipo 1, che viene prodotta in eccesso nei pazienti con malattia di Crohn. Si prevede di studiare l'efficacia dello stesso oligonucleotide per il trattamento di altri malattie infiammatorie, Per esempio artrite reumatoide, psoriasi e colite ulcerosa.

In linea di principio, gli oligonucleotidi "antisenso" possono formare una tripla elica con un DNA cromosomico bersaglio e bloccare la trascrizione. Tuttavia, finora la specificità degli oligonucleotidi “antigenici” non soddisfa gli standard adottati per i farmaci.

Medicina per i geni

Il sogno di lunga data dei medici è quello di avere a disposizione sostanze che agiscano su geni specifici, ad es. alla causa principale di molte malattie. Infatti, sulla base di tali sostanze, è possibile creare farmaci - veri e propri "proiettili magici" in grado di attaccare il materiale ereditario di vari agenti infettivi senza causare danni al corpo umano, oltre a sopprimere l'attività degli oncogeni responsabili delle malattie maligne crescita cellulare. La creazione di tali sostanze che influenzano specificamente il materiale genetico è uno dei compiti principali della biologia molecolare, poiché con il loro aiuto è possibile studiare le funzioni dei geni e, in definitiva, controllare il lavoro di questi ultimi

Ma come si può modificare il programma genetico desiderato? Dopotutto, tutti i geni sono simili Composizione chimica e struttura: le differenze tra loro si riducono solo all'ordine di alternanza di quattro blocchi monomerici - nucleotidi A, T, G, C. Per influenzare un gene specifico, una molecola di una sostanza deve in qualche modo riconoscere questa sequenza nucleotidica - un compito, a prima vista, irrisolvibile.

Ma un gruppo di chimici siberiani che vennero alla Città Accademica di Novosibirsk nei primi anni della sua creazione la pensavano diversamente. Personale dell'istituto chimica organica Ramo siberiano dell'Accademia delle scienze dell'URSS (Novosibirsk), N.I. Grineva e D.G. Knorre, basandosi sul principio del riconoscimento molecolare utilizzato dalla natura stessa, formularono l'idea dell'influenza diretta sui geni utilizzando oligonucleotidi - frammenti di acidi nucleici, “armati” di speciali gruppi chimici. I chimici siberiani pubblicarono il loro primo lavoro sugli oligonucleotidi nel 1967: questa data è oggi considerata la data ufficiale dell'emergere di una nuova direzione nella biologia molecolare e nella farmacologia.

Sono stati i primi

L’implementazione di questo progetto insolitamente audace (a quel tempo nessuna ricerca del genere era nemmeno pianificata in nessuna parte del mondo) stato inizialeè stato condotto da un piccolo gruppo di giovani dipendenti, dottorandi e studenti della NSU. Bisognava cominciare praticamente da zero, poiché a quel tempo non si sapeva ancora come sintetizzare gli oligonucleotidi in quantità apprezzabili; non c'erano strumenti tecnici necessari per lavorare con piccole quantità di acidi nucleici e metodologia efficace determinandone la sequenza. I nostri chimici sono riusciti a risolvere questi problemi grazie all'interdisciplinarietà, uno dei principi che hanno costituito la base delle attività del ramo siberiano.

Al NIOH è stata organizzata la produzione di acidi nucleici e sono stati sviluppati metodi per la loro modificazione chimica; insieme ai dipendenti dell'Istituto di fisica nucleare, è stato possibile creare strumenti per analizzare gli acidi nucleici e manipolarne piccole quantità e, insieme ai chimici dell'Università statale di Mosca, hanno iniziato a lavorare sulla creazione di sintetizzatori automatici di oligonucleotidi. Di conseguenza, gli scienziati avevano a disposizione quasi tutti i metodi e gli strumenti analitici necessari: la ricerca biologica poteva iniziare.

Esperimenti effettuati per primi modelli semplici, e poi sugli acidi nucleici naturali, hanno dimostrato che gli oligonucleotidi interagiscono effettivamente con gli acidi nucleici bersaglio con un elevato grado di selettività. Nel caso in cui gruppi reattivi siano attaccati agli oligonucleotidi, si verifica una modifica chimica diretta dei bersagli: gli acidi nucleici. Inoltre, per la prima volta è stato dimostrato che con l'aiuto di questi reagenti è possibile sopprimere le infezioni virali negli animali ed è stata anche dimostrata la possibilità di introdurle nel corpo attraverso la pelle, le mucose, ecc.

Le prime pubblicazioni sugli effetti biologici prodotti dagli oligonucleotidi suscitarono grande interesse tra gli specialisti di tutto il mondo. Nel 1988 si è tenuto ad Akademgorodok il primo simposio al mondo sulle sostanze mirate ai geni basate su frammenti di acido nucleico. Nel lavoro di creazione farmaci simili Furono coinvolti scienziati dagli Stati Uniti, dalla Francia e poi da altri paesi; Sono emerse dozzine di aziende con l'obiettivo di creare farmaci terapeutici basati su oligonucleotidi.

Medicina complementare

Il primo dei farmaci mirati ai geni sono stati i cosiddetti oligonucleotidi antisenso, progettati per inattivare selettivamente gli RNA virali e alcuni RNA cellulari. Inizialmente, si presumeva che a questi oligonucleotidi fossero attaccati gruppi reattivi che avrebbero modificato o distrutto chimicamente gli acidi nucleici bersaglio. Tuttavia, si è scoperto che l'attaccamento degli oligonucleotidi all'RNA bersaglio stesso ha un tale impatto su di esso grande influenza, che può provocarne la distruzione da parte degli enzimi cellulari.

D. G. KNORRE - accademico dell'Accademia russa delle scienze, specialista nel settore cinetica chimica, biologia molecolare e chimica bioorganica. Capo del Laboratorio di Chimica dei Polimeri Naturali (1960-1984), Dipartimento di Biochimica e Laboratorio di Chimica degli Acidi Nucleici (1970-1984) dell'Istituto di Chimica Organica della Sezione Siberiana dell'Accademia delle Scienze dell'URSS, Direttore dell'Istituto di Chimica bioorganica della sezione siberiana dell'Accademia delle scienze dell'URSS e della sezione siberiana dell'Accademia delle scienze russa (1984-1996). Gli approcci antisenso basati sull'uso di nucleotidi e acidi nucleici per sopprimere l'attività biologica degli acidi nucleici promettono prospettive interessanti nei casi in cui è necessario sopprimere l'implementazione di informazioni indesiderate negli organismi viventi. Innanzitutto si apre la prospettiva di creare una nuova generazione di farmaci antivirali e antitumorali. Tali farmaci hanno un vantaggio innegabile rispetto ad altri... Tutti gli oligonucleotidi, indipendentemente dall'obiettivo a cui sono mirati, possono essere creati utilizzando un'unica tecnologia. È necessario variare solo la sequenza nucleotidica. In particolare, in virologia e oncologia ci si trova spesso a fare i conti con il fenomeno della farmacoresistenza. Ciò accade più spesso a causa di un individuo particella virale o separato cellula tumorale si verifica una mutazione che porta a tale resistenza. In ogni altro caso, è necessario avviare una ricerca empirica per un nuovo farmaco. Nel caso degli effetti antisenso è solo necessario determinare quale cambiamento nella struttura del genoma virale o dell'oncogene ha portato alla comparsa della resistenza. Dopodiché diventa subito chiaro come creare un nuovo farmaco utilizzando la stessa tecnologia unificata*.

* Rivista educativa Soros. - 1998. - 12. - pp. 25-31.

Più uno strumento potente Si è scoperto che i geni che "spengono" interferiscono con l'RNA: brevi complessi a doppio filamento di oligonucleotidi di RNA. Quando un tale complesso viene introdotto in una cellula, una delle catene si lega alla sua sequenza complementare nell'RNA messaggero della cellula. Questo serve come segnale per l'inizio di un gruppo di enzimi che tagliano l'RNA associato agli oligonucleotidi. Di conseguenza, il programma per sintetizzare una particolare proteina scompare.

Nel 2006, per aver spiegato il meccanismo dell'interferenza dell'RNA, furono premiati due ricercatori americani premio Nobel in fisiologia e medicina. La creazione di regolatori dell'espressione genica basati sull'RNA interferente ha aperto grandi opportunità di ottenimento vasta gamma farmaci non tossici altamente efficaci che sopprimono l'espressione di quasi tutti i geni, compresi i geni tumorali e virali.

Mutazioni corrette

L'attenzione degli specialisti è stata a lungo attratta dai metodi di effetti mutageni sul DNA utilizzando oligonucleotidi o loro derivati. In caso di successo, ciò che oggi sembra fantascienza potrebbe diventare realtà: la correzione di programmi genetici difettosi.

È già stato dimostrato sperimentalmente che utilizzando oligonucleotidi corti è possibile introdurre mutazioni puntiformi nei programmi genetici. Come fare questo? Gli oligonucleotidi mutageni contenenti blocchi nucleotidici "sbagliati" vengono introdotti nella cellula, dove si combinano con il DNA. Di conseguenza, in alcune parti delle sequenze nucleotidiche compaiono coppie di basi “errate”, cioè non complementari, il che viene percepito sistema cellulare riparazione (“riparazione”) del DNA come danno. I nucleotidi di tale coppia vengono sostituiti da enzimi riparatori in modo che diventi “corretto”, complementare. In questo caso la sostituzione può avvenire sia nella sequenza oligonucleotidica che nel DNA cellulare stesso.

In quest’ultimo caso si tratta di un cambiamento nel programma genetico, cioè di una mutazione. E sebbene l'efficienza di un tale processo di mutazione sia generalmente bassa, può essere utilizzata in relazione al nuovo tecnologie cellulari. Ad esempio, le cellule staminali di un paziente con qualsiasi disturbo ereditario possono essere trattate con un mutageno selettivo, e poi quelle in cui è avvenuta la mutazione desiderata (cioè cellule con un programma genetico “corretto”) possono essere selezionate, moltiplicate e introdotte nell'organismo.

1967 Viene pubblicato il primo lavoro sugli oligonucleotidi, sostanze biologicamente attive mirate ai geni

Pertanto, gli oligonucleotidi oggi esistenti sono in grado di regolare il “lavoro” dei geni a vari livelli. Pertanto, i suddetti oligonucleotidi antisenso e gli RNA interferenti funzionano nella fase di sintesi proteica, influenzando gli RNA messaggeri - molecole di informazione in cui sono assemblate le catene polipeptidiche. Gli oligonucleotidi antigenici che formano complessi con il DNA sopprimono l'espressione genica: la formazione degli stessi RNA messaggeri e gli aptameri oligonucleotidici possono, come gli anticorpi, formare legami con determinate proteine, bloccandole. Inoltre, alcuni oligonucleotidi sono in grado di stimolare il lavoro sistema immunitario- oggi vengono utilizzati come componenti dei vaccini.

Attualmente, lo sviluppo e la sintesi degli oligonucleotidi e dei loro analoghi è portato avanti da ampi settori industriali e di ricerca. Pertanto, lo scorso anno il volume di mercato degli oligonucleotidi destinati esclusivamente alla ricerca ha superato gli 800 milioni di dollari! Sono stati sviluppati e sintetizzati decine di nuovi tipi di oligonucleotidi modificati chimicamente e sono in fase di sperimentazione numerosi farmaci antivirali e antinfiammatori da essi derivati. Ricerca questo tipo in Russia vengono ora svolti principalmente presso l'Istituto di Biologia Chimica e Medicina Fondamentale della SB RAS, dove lavorano studenti e seguaci dell'Accademico D. G. Knorre.

È così che la vita stessa ha dimostrato la fecondità dell'idea nata nel ramo siberiano quarant'anni fa. Utilizzando come strutture di base per creare geni biologicamente mirati sostanze attive brevi frammenti di acidi nucleici, farmaci specifici contro quasi tutti i virus possono essere rapidamente sviluppati e messi in produzione. Per fare ciò, devi solo decifrare la sequenza nucleotidica dei geni virali, cosa facile da fare tecnologie moderne. Questo approccio universale ha un grande futuro: i risultati della ricerca anni recenti, in particolare mediante mutagenesi diretta, ci permettono di contarne la comparsa in un prossimo futuro medicinali efficaci per combattere malattie ancora considerate incurabili.

Una direzione promettente è lo sviluppo delle tecnologie genetiche.

1. Sono in grado di ottimizzare significativamente la farmacoterapia tradizionale (farmacogenomica).

2. Particolari speranze sono riposte nello sviluppo dell'ingegneria genetica di farmaci per la protezione contro le malattie infettive e gli agenti patogeni.

Un'altra direzione sono i farmaci biotecnologici. Inizia la competizione tra i farmaci di sintesi tradizionali e quelli biofarmaceutici. Il nuovo termine “biofarmacia” sta diventando un luogo comune.

Nel 2006, il mercato farmaceutico globale valeva circa 640 miliardi di dollari, di cui i prodotti biotecnologici rappresentavano già il 10%. I leader nel campo della biofarmacia sono gli Stati Uniti e la Germania.

Lo sviluppo dei moderni prodotti biofarmaceutici è stato preceduto dallo sviluppo di altri metodi biotecnologici, in particolare la fermentazione di batteri e funghi, che ha permesso di sviluppare produzione industriale farmaci a piccole molecole, come antibiotici, inibitori dell’HMG-CoA reduttasi (idrossimetilglutaril-coenzima A reduttasi) e immunosoppressori. I medicinali biotecnologici sono medicinali destinati alla prevenzione, al trattamento o alla diagnosi in vivo, che si sviluppano non farmacologicamente, ma attività biologica. Presentano una serie di differenze significative rispetto ai farmaci chimico-sintetici. Sostanza attiva farmaci biotecnologici ha origine biologica ed è derivato da cellule viventi e ha una struttura molecolare eterogenea complessa. Il substrato iniziale sono cellule di origine animale o microrganismi (batteri come E. coli, lievito, ecc.), vengono utilizzate le loro strutture cellulari e subcellulari.

Una differenza significativa tra i farmaci biotecnologici è che utilizzano la naturale capacità di metabolizzare.

Per ottenerli, il DNA genomico del prodotto originale viene isolato e modificato in modo tale da acquisire una nuova capacità di biosintesi, non specie-specifica, che viene utilizzata in medicina. Innanzitutto va menzionata la creazione di organismi geneticamente modificati per la produzione di proteine ​​terapeutiche ricombinanti. Attualmente sono già in uso 115 farmaci basati su 84 proteine ​​terapeutiche. Nel 2006 erano 418 i farmaci biofarmaceutici in fase di sviluppo negli Stati Uniti e 320 in Europa, alcuni dei quali sono già in fase di sperimentazione. ricerche cliniche e presto saranno disponibili ai medici e ai loro pazienti. Secondo previsioni ottimistiche, nel 2015, la metà dei farmaci innovativi nel mondo sarà basata su proteine ​​o oligonucleotidi. Dovremmo anche aspettarci l'ingresso nel mercato farmaceutico di una nuova categoria di medicinali: i biosimilari, analoghi dei medicinali biotecnologici originali con una molecola attiva simile ma non identica. Quest'anno sono stati registrati nell'UE i primi due biosimilari (ormone della crescita - somatotropina). Circa 12 biosimilari (eritropoietina, ecc.) sono registrati presso l'Agenzia europea per i medicinali. Si prevede che un'introduzione a pratica medica i biosimilari ridurranno drasticamente i costi sanitari per i medicinali biotecnologici e li renderanno accessibili al grande pubblico. I medici ne avranno ancora di più farmaci efficaci per combattere malattie gravi, molte delle quali prima erano considerate incurabili.

04.07.2013 - 31.12.2013

È stata effettuata un'analisi sistematica letteratura moderna sul tema della ricerca. Sono state stabilite le sequenze dei derivati ​​più promettenti, dal punto di vista degli implementatori del progetto, degli oligonucleotidi e dei loro analoghi, che dovrebbero presentare attività antivirale e antibatterica.
Sono stati sviluppati metodi per la sintesi di oligonucleotidi modificati e dei loro coniugati utilizzando sintetizzatori automatici di DNA/RNA o sintesi non automatizzata su un supporto allo stato solido. Sono stati proposti vari approcci per la progettazione di derivati ​​oligonucleotidici con una determinata funzionalità, compresi quelli basati sull'analisi predittiva della struttura e della stabilità dei duplex formati utilizzando il metodo della dinamica molecolare. È stato proposto un metodo per la sintesi di nuovi derivati ​​oligonucleotidici precedentemente non descritti recanti modifiche nell'atomo di fosforo del gruppo fosfodiestere dell'internucleotide.
È stato sviluppato un metodo per analizzare l'efficienza della penetrazione dei composti marcati con fluoresceina nelle cellule batteriche. È stato dimostrato che i derivati ​​caricati positivamente del peptide Flu-(LR)4G-ammide penetrano e si accumulano efficacemente nello Pseudomonas aeruginosa, mentre l'efficienza di penetrazione degli oligonucleotidi senza un peptide di trasporto al suo interno è bassa.
Tutti i metodi sviluppati durante la ricerca, sia sintetici che analitici, sono stati introdotti nel lavoro del Laboratorio di Chimica Biomedica dell'Istituto di Medicina Biomedica SB RAS. Gli sviluppi teorici ottenuti sono stati utilizzati nei percorsi didattici.
La base sintetica creata in laboratorio per la produzione, l'isolamento e la caratterizzazione degli oligonucleotidi è unica per la Federazione Russa ed è vicina al livello dei migliori laboratori di ricerca del mondo con la specializzazione corrispondente. Il coinvolgimento di specialisti biologici rende il laboratorio unico nel suo potenziale di ricerca nella direzione dello sviluppo di farmaci antivirali e antibatterici mirati all'RNA.

Espandere

01.01.2014 - 31.12.2014

i) Valutazione dell'attività antibatterica di analoghi oligonucleotidici/coniugati oligonucleotidici contro Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus;
ii) Valutazione dell'attività antivirale di analoghi oligonucleotidici/coniugati oligonucleotidici contro il virus dell'influenza WSN33/A/H1N1.
iii) Selezione di sequenze di analoghi oligonucleotidici leader che mostrano attività antibatterica o antivirale al livello richiesto;
iv) Sviluppo di protocolli per la sintesi di coniugati oligonucleotidici contenenti gruppi che aumentano l'efficienza del loro accumulo nelle cellule eucariotiche o batteriche
iv) Valutazione dell'efficienza di penetrazione e accumulo dei composti sviluppati in cellule batteriche ed eucariotiche.
v) Laboratorio preparato;
vi) Articoli su riviste scientifiche indicizzate nel Web of Science.
vii) Abstract di relazioni a convegni;
viii) Certificati di partecipazione a corsi formativi;
ix) Conferenza;

Espandere

01.01.2015 - 31.12.2015

3.1 Attività antibatterica di composti contenenti sequenze leader contro Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus in vitro (in coltura cellulare);
3.2 Attività antivirale di composti contenenti sequenze leader contro il virus dell'influenza in vitro;

3.3. Tecnologico e caratteristiche terapeutiche analoghi e coniugati oligonucleotidici selezionati, tenendo conto delle vie di commercializzazione dei farmaci, tra cui:

3.3.1 Elenco di metodi sperimentali standardizzati per la valutazione dell'attività antibatterica e antivirale di farmaci analoghi degli oligonucleotidi in vitro (in colture cellulari) e in vivo (in modelli animali);

3.3.3 Analoghi e coniugati oligonucleotidici selezionati che, insieme alla manifestazione di elevata attività antibatterica e antivirale, sono in grado di penetrare e accumularsi efficacemente nelle cellule, tra cui:

3.3.2.1 Dati sulla penetrazione cellulare e sul rilascio di analoghi e coniugati oligonucleotidici modificati;
3.3.2.2 Sintesi semi-preparativa ottimizzata, modifiche pre e post-sintetiche, isolamento e controllo quantitativo di analoghi oligonucleotidici che presentano attività antibatterica e antivirale;
3.3.2.3. Valutazione dei composti sviluppati con attività antibatterica e antivirale dal punto di vista dell'uso commerciale.

3.4 Rapporto finale preparato per il Progetto;
3.5 Laboratorio preparato;

3.6 Abstract di relazioni a convegni;
3.7 Certificati di partecipazione a corsi formativi;

3.8 3 articoli su periodici scientifici indicizzati nel Web of Science

L'RNA antisenso, che dovrebbe essere utilizzato come farmaco, è un oligonucleotide corto (15-20 nucleotidi) in grado di legarsi a una regione specifica dell'mRNA complementare ad esso e inibire la traduzione della proteina che codifica, sopprimendo così il processo patologico (Fig. 2).

L'effetto terapeutico degli oligonucleotidi sintetici "antisenso" dipende dalla specificità della loro ibridazione con il sito accessibile dell'mRNA bersaglio, dalla resistenza all'azione delle nucleasi cellulari e dalla presenza di un sistema di rilascio nella cellula. 15-20 sequenze nucleotidiche si ibridano con mRNA unici con specificità piuttosto elevata. I potenziali siti bersaglio vengono identificati testando una serie di oligonucleotidi “antisenso” utilizzando una coltura di cellule che sintetizzano l'mRNA bersaglio. Per fare ciò, viene effettuata la separazione elettroforetica delle proteine ​​cellulari, in cui durante la traduzione viene inclusa un'etichetta radioattiva e mediante autoradiografia viene determinato in presenza di quale degli oligonucleotidi “antisenso” la sintesi di una particolare proteina viene ridotta. Non esistono criteri generali per selezionare i migliori siti bersaglio nei diversi trascritti di RNA. Possono essere efficaci oligonucleotidi complementari alle estremità da 5" o 3" dell'mRNA, ai confini dell'esone e dell'introne e persino alle regioni a doppio filamento. Gli oligonucleotidi antisenso possono essere distrutti dalle nucleasi intracellulari, quindi è importante proteggerli dall'azione di queste ultime affinché non perdano la capacità di ibridarsi con il bersaglio. Per fare ciò, le basi pirimidiniche, ribosio o desossiribosio possono essere modificate in un certo modo (Fig. 3). Pertanto, negli oligonucleotidi “antisenso” attualmente più utilizzati, l’atomo di ossigeno libero del legame fosfodiestere è sostituito da un gruppo SH (Fig. 3B ), con conseguente formazione di un legame tiofosfato. Gli oligonucleotidi così modificati si dissolvono in acqua, portano una carica negativa e non vengono scissi dalle endonucleasi. Quando ibridati su un sito bersaglio, formano duplex che attivano la ribonucleasi (RNasi), un enzima endogeno che scinde l'mRNA in tale molecola ibrida. Sono stati condotti i primi studi clinici su tali oligonucleotidi, farmaci di “prima generazione”. Gli obiettivi sono l'RNA del citomegalovirus, il virus dell'immunodeficienza umana, nonché l'mRNA dei geni responsabili dello sviluppo del cancro, delle malattie intestinali e di altre malattie.

Sono stati sintetizzati oligonucleotidi “antisenso” con legami fosforamiditici e poliammidici (peptidici) - acidi nucleici peptidici (PNA) (Fig. 3 B e D ). Tali molecole sono molto resistenti alle nucleasi. I gruppi chimici attaccati all'atomo di carbonio da 2" del residuo di zucchero e all'atomo C-5 delle pirimidine proteggono anche gli oligonucleotidi antisenso e facilitano il loro legame al sito bersaglio (Fig. 3 2D E E ). Tutti i vantaggi di queste e altre modifiche vengono ora studiati intensamente.

La penetrazione degli oligonucleotidi “antisenso” nella cellula può essere notevolmente facilitata inserendoli nei liposomi. Questo sistema di rilascio altamente efficiente consente l'uso di oligonucleotidi antisenso a basse concentrazioni. Se i liposomi vengono coniugati con anticorpi specifici per gli epitopi di determinate cellule di determinati organi, sarà possibile effettuare il rilascio mirato di oligonucleotidi “antisenso”.

Studi preclinici hanno dimostrato che gli oligonucleotidi “antisenso” sono farmaci molto efficaci. È stata studiata la possibilità del loro utilizzo per il trattamento della stenosi delle arterie coronarie e carotidi, che porta ad infarti e ictus. In questi casi si ricorre spesso all'angioplastica, dilatando le arterie mediante catetere a palloncino, ma in circa il 40% dei pazienti la stenosi si ripresenta dopo 6 mesi, poiché l'angioplastica stimola la proliferazione delle cellule muscolari lisce e la secrezione di sostanza intercellulare all'interno strato dell'arteria nel sito della sua dilatazione. In un esperimento, oligonucleotidi antisenso con legami tiofosfato, complementari agli mRNA che codificano per proteine ​​importanti per il ciclo cellulare dei mammiferi, sono stati iniettati nelle arterie carotidi dei ratti dopo angioplastica; di conseguenza, il tasso di restenosi è diminuito del 90%. La proliferazione delle cellule muscolari lisce si verifica anche nell'aterosclerosi, nel diabete mellito e nelle complicanze dopo l'impianto di bypass dell'arteria coronaria. È probabile che tutte queste condizioni possano essere controllate in modi simili.

Gli oligonucleotidi “Antisol” possono essere utilizzati anche per trattare le infezioni virali e la malaria. Inoltre, i risultati di uno studio clinico di fase I per il trattamento della malattia di Crohn con la somministrazione orale di un oligonucleotide antisenso hanno evidenziato un chiaro effetto terapeutico senza effetti collaterali evidenti. In questo caso, l'mRNA bersaglio codificava l'adesione intercellulare di tipo 1, che viene prodotta in eccesso nei pazienti con malattia di Crohn. Si prevede di studiare l'efficacia dello stesso oligonucleotide per il trattamento di altre malattie infiammatorie, come l'artrite reumatoide, la psoriasi e la colite ulcerosa.

In linea di principio, gli oligonucleotidi "antisenso" possono formare una tripla elica con un DNA cromosomico bersaglio e bloccare la trascrizione. Tuttavia, finora la specificità degli oligonucleotidi “antigenici” non soddisfa gli standard adottati per i farmaci.