В большинстве методов генной терапии ех vivo и in vivo используются клонированные ге­нетические конструкции, возмещающие функ­циональную форму белка, который не синтези­руется в организме больного или синтезируется в дефектной форме. Однако многие заболевания человека (рак, воспаления, вирусные и парази­тарные инфекции) связаны, напротив, с гиперпродукцией нормального белка. Для лечения та­ких состояний разработаны терапевтические

системы с использованием специфических олигонуклеотидов. Такой небольшой олигонуклеотид может гибридизоваться со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции или трансляции, уменьшая тем самым количество синтезируемого белка, ответственного за патологию. Олигонук­леотид, который гибридизуется с самим геном и блокирует его транскрипцию, называется «анти­генным», а тот, который гибридизуется с соот­ветствующей мРНК, - «антисмысловым» (Antisense RNA). Для предотвращения активации транскрип­ции специфических генов можно так-же использовать двухцепочечные олигонуклеотиды, специфично присоединя­ющиеся к ДНК-связывающим белкам (белкам-активаторам). Наконец, для уменьшения количества определенной мРНК и синтезируе­мого на ней белка можно использовать рибозимы - природные РНК-последовательности, которые связываются со специфическими моле­кулами РНК и разрезают их.

В будущем лекарст­венные средства на основе нуклеиновых кислот, по-видимому, найдут широкое применение, при этом главным объектом научных исследований и клинических испытаний будут различные «анти­смысловые» олигонуклеотиды.

3.1..«Антисмысловые» олигонуклеотиды как лекарственные средства

«Антисмысловая» РНК (Antisense RNA), которую предполагает­ся использовать в качестве лекарственного сред­ства, представляет собой короткий (15-20-нуклеотидов) олигонуклеотид, который может связываться с комплементарным ей определенным участком мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка, подавляя тем самым патологический процесс (рис.2).

Терапевтический эффект синтетических «анти­смысловых» олигонуклео-тидов зависит от спе­цифичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к дейст­вию клеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку. 15-20-нуклеотидные последо­вательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тес­тированием набора «антисмысловых» олигону­клеотидов с использованием культуры клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Для этого про­водят электрофоретическое разделение клеточ­ных белков, в которые включают радиоактив­ную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутст­вии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5"- или 3"-концам мРНК, границам экзонов и интронов и даже двухцепочечным областям. Антисмысловые олигонуклеотиды могут разрушаться внутрикле­точными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утра­тили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определен­ным образом пиримидиновые основания, рибозу или дезоксирибозу (рис.3). Так, у наиболее ши­роко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на группу SH (рис. 3Б), в результате чего образу­ется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщеп­ляются под действием эндонуклеаз. При гиб­ридизации с сайтом-мишенью они образуют дуплексы, которые активируют рибонуклеазу (РНКазу), эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в такой гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания та­ких олигонуклеотидов - лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефици­та человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний.

Синтезированы «антисмысловые» олигонук­леотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями - пептидные нуклеиновые кислоты (Peptide nucleicacids, PNAs) (рис.3В и Г ). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2"-угле­родному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысло­вые» олигонуклеотиды и облегчают их связыва­ние с сайтом-мишенью (рис. 32Д и Е ). Все преимущества этих и других модификаций сей­час интенсивно изучаются.

Проникновение «антисмыловых» олигонук­леотидов в клетку можно значительно облег­чить, поместив их в липосомы. Такая высокоэффективная система доставки позволяет ис­пользовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с антителами, специфичными к эпитопам определенных клеток тех или иных органов, то можно будет осуществлять адресную доставку «антисмысловых» олигонуклеотидов.

Проведенные доклинические испытания оказали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекартвенными средствами. Изучена возможность их применения для лечения стеноза коронарых и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через 6 месяцев вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрецию межклеточного вещества во внутренний слой артерии в месте ее расширения. В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного циклa млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток про­исходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования. Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами.

«Антисмыловые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты I фазы клини­ческих испытаний лечения болезни Крона с по­мощью орального введения «антисмыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко вы­раженный терапевтический эффект без замет­ных побочных эффектов. В этом случае мРНК-мишень кодировала межклеточный адгезии типа 1, который вырабатывается в избытке у па­циентов с болезнью Крона. Предполагается ис­следовать эффективность этого же олигонукле­отида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревматоидного артрита, псориаза и язвенного колита.

В принципе «антисмысловые» олигонуклео­тиды могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мишенью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклеотидов не соответст­вует стандартам, принятым для лекарственных средств.

Лекарство для генов

Давняя мечта медиков - иметь в своем распоряжении вещества, которые действовали бы на конкретные гены, т.е. на первопричину многих болезней. Ведь на основе таких веществ можно создавать лекарственные препараты - настоящие «волшебные пули», способные поражать наследственный материал различных инфекционных агентов, не принося вреда организму человека, а также подавлять активность онкогенов, ответственных за злокачественный рост клеток. Создание подобных веществ, направленно воздействующих на генетический материал, - одна из главных задач молекулярной биологии, поскольку с их помощью можно исследовать функции генов и, в конечном счете, управлять работой последних

Но каким образом можно изменить нужную генетическую программу? Ведь все гены имеют сходные химический состав и структуру: различия между ними сводятся лишь к порядку чередования четырех мономерных блоков - нуклеотидов A, T, G, C. Для того чтобы воздействовать на определенный ген, молекула вещества должна каким-то образом распознать эту нуклеотидную последовательность - задача, на первый взгляд, неразрешимая.

Но группа сибирских химиков, приехавших в Новосибирский академгородок в первые годы его создания, считала иначе. Сотрудники Института органической химии СО АН СССР (Новосибирск) Н. И. Гринева и Д. Г. Кнорре на основе принципа молекулярного узнавания, используемого самой природой, сформулировали идею направленного воздействия на гены с помощью олигонуклеотидов - фрагментов нуклеиновых кислот, «вооруженных» специальными химическими группами. Первую работу по олигонуклеотидам сибирские химики опубликовали в 1967 г. - именно эта дата и считается сегодня официальной датой возни­кновения нового направления в молекулярной биологии и фармакологии.

Они были первыми

Осуществление этого необычного по смелости проек­та (в то время нигде в мире даже не планировалось проведение подобных исследований) на начальной стадии велось небольшой группой молодых сотрудников, аспирантов и студентов НГУ. Начинать пришлось практически с нуля, поскольку тогда еще не умели синтезировать олигонуклеотиды в заметных количествах; не существовало технических приборов, необходимых для работы с малыми количествами нуклеиновых кислот и эффективной методики определения их последовательности. Решить эти проблемы нашим химикам удалось благодаря междисциплинарности - одному из принципов, легших в основу деятельности Сибирского отделения.

В НИОХ было организовано производство нуклеиновых кислот, разработаны методы их химической модификации; совместно с сотрудниками Института ядерной физики удалось создать приборы для анализа нуклеиновых кислот и манипуляции с их малыми количествами, а совместно с химиками МГУ - развернуть работы по созданию автоматических синтезаторов олигонуклеотидов. В результате в распоряжении ученых оказались практически все необходимые аналитические методы и приборы - биологические исследования можно было начинать.

Эксперименты, проведенные сначала на простых моделях, а затем на природных нуклеиновых кислотах, показали, что олигонуклеотиды действительно взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами - мишенями с высокой степенью избирательности. В том случае, когда к олигонуклеотидам присоединены реакционно-способные группы, происходит направленная химическая модификация мишеней - нуклеиновых кислот. К тому же, впервые было продемонстрировано, что с помощью этих реагентов можно подавить вирусные инфекции у животных, а также доказана возможность введения их в организм через кожу и слизистые оболочки и т. п.

Ранние публикации, посвященные биологическим эффектам, производимым олигонуклеотидами, вызвали огромный интерес специалистов во всем мире. В 1988 г. в Академгородке был проведен первый в мире симпозиум по ген-направленным веществам на основе фрагментов нуклеиновых кислот. В работу по созданию подобных препаратов включились ученые США, Франции, а затем и других стран; возникли десятки компаний, поставивших перед собой цель создать терапевтические препараты на основе олигонуклеотидов.

Комплементарное лекарство

Первыми из препаратов ген-направленного действия стали так называемые антисмысловые олигонуклеотиды, предназначенные для избирательной инактивации вирусных РНК и некоторых клеточных РНК. Изначально предполагалось, что к этим олигонуклеотидам будут присоединены реакционно-способные группы, которые должны химически модифицировать или разрушать целевые нуклеиновые кислоты. Однако выяснилось, что присоединение олигонуклеотидов к РНК-мишени само по себе оказывает на нее настолько большое влияние, что может провоцировать ее разрушение клеточными ферментами.

Д. Г. КНОРРЕ - академик РАН, специалист в области химической кинетики, молекулярной биологии и биоорганической химии. Заведующий лабораторией химии природных полимеров (1960-1984 гг.), отделом биохимии и лабораторией химии нуклеиновых кислот (1970-1984 гг.) Института органической химии СО АН СССР, директор Института биоорганической химии СО АН СССР и СО РАН (1984-1996 гг.) Антисмысловые подходы, основанные на использовании нуклеотидов и нуклеиновых кислот для подавления биологической активности нуклеиновых кислот, сулят интересные перспективы в тех случаях, когда нужно задавить реализацию нежелательной информации в живых организмах. В первую очередь открывается перспектива создания нового поколения противовирусных и противоопухолевых препаратов. Такие препараты имеют одно неоспоримое преимущество перед другими… Все олигонуклеотиды независимо от мишени, на которую они нацелены, могут быть созданы по единой технологии. Варьировать нужно только последовательность нуклеотидов. В частно­сти, в вирусологии и онкологии часто приходится сталкиваться с таким явлением, как возникновение устойчивости к препаратам. Это происходит чаще всего потому, что у отдельной вирусной частицы или отдельной раковой клетки происходит мутация, приводящая к такой устойчивости. В любом другом случае нужно начинать эмпирический поиск нового лекарственного препарата. В случае антисмысло­вых воздействий нужно только определить, какое изменение в структуре вирусного генома или онкогена привело к появлению устойчивости. После чего сразу становится ясным, как по той же единой технологии создавать новый препарат *.

* Соросовский образовательный журнал. - 1998. - 12. - C. 25-31.

Самым мощным средством «выключения» генов оказались интерферирующие РНК - короткие двуцепочечные комплексы из РНК-олигонуклеотидов. Когда такой комплекс вводят в клетку, одна из цепочек связывается с комплементарной ей последовательностью в информационной РНК клетки. Это служит сигналом к началу работы группы ферментов, которые разрезают РНК, связанную с олигонуклеотидами. В результате программа синтеза определенного белка исчезает.

В 2006 г. за объяснение действия механизма РНК-интерференции два американских исследователя были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине. Создание регуляторов экспрессии генов на основе интерферирующих РНК открыло большие возможности для получения широкого спектра высокоэффективных нетоксичных препаратов, подавляющих экспрессию практически всех, в том числе опухолевых и вирусных, генов.

Правильные мутации

Внимание специалистов давно привлекают и методы мутагенного воздействия на ДНК с помощью олигону­клеотидов или их производных. В случае успеха может стать реальным то, что сегодня кажется фантастикой: коррекция дефектных генетических программ.

Экспериментально уже доказано, что с помощью коротких олигонуклеотидов можно вносить в генетические программы точечные мутации. Как это осуще­ствить? Мутагенные олигонуклеотиды, содержащие «неправильные» нуклеотидные блоки, вводятся в клетку, где они соединяются с ДНК. В результате в некоторых участках нуклеотидных последовательностей появляются «неправильные», т. е. некомплементарные, пары оснований, что и воспринимается клеточной системой репарации («ремонта») ДНК как повреждение. Нуклеотиды в подобной паре заменяются репаративными ферментами таким образом, чтобы она стала «правильной», комплементарной. При этом замена может происходить как в олигонуклеотидной последовательности, так и в самой клеточной ДНК.

В последнем случае мы имеем дело с изменением генетической программы, т. е. с мутацией. И хотя эффективность подобного мутационного процесса в целом невелика, он может быть использован применительно к новым клеточным технологиям. Например, стволовые клетки больного с каким-либо наследственным нарушением можно обработать избирательным мутагеном, а затем отобрать те из них, в которых произошла нужная мутация (т. е. клетки с «исправленной» генетической программой), размножить и ввести в организм.

1967 г. Опубликована первая работа по олигонуклеотидам - ген-направленным биологически активным веществам

Таким образом, существующие на сегодняшний день олигонуклеотиды способны регулировать «работу» генов на различных уровнях. Так, вышеупомянутые антисмысловые олигонуклеотиды и интерферирующие РНК работают на стадии синтеза белка, воздействуя на матричные РНК - информационные молекулы, в которых происходит сборка полипептидных цепочек. Антигенные олигонуклеотиды, образующие комплексы с ДНК, подавляют экспрессию генов - образование самих матричных РНК, а олигонуклеотиды-аптамеры могут, подобно антителам, образовывать связи с определенными белками, блокируя их. Кроме того, некоторые олигонуклеотиды способны стимулировать работу иммунной системы - сегодня их используют в качестве компонентов вакцин.

В настоящее время разработку и синтез олигонуклеотидов и их аналогов ведут большие исследовательский и индустриальный секторы. Так, в прошлом году только объем рынка олигонуклеотидов, предназначенных для исследовательских целей, превысил 800 млн долларов! Сейчас разработаны и синтезированы десятки новых видов химически модифицированных олигонуклеотидов, идут испытания ряда противовирусных и противовоспалительных препаратов, полученных на их основе. Исследования подобного рода в России сейчас проводятся в основном в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, где работают ученики и последователи академика Д. Г. Кнорре.

Вот так плодотворность идеи, возникшей в Сибирском отделении сорок лет назад, была доказана самой жизнью. Используя в качестве базовых структур для создания ген-направленных биологически активных веществ короткие фрагменты нуклеиновых кислот, можно быстро разработать и внедрить в производство специфические лекарственные препараты практически против любого вируса. Для этого необходимо лишь расшифровать нуклеотидную последовательность вирусных генов, что несложно сделать с помощью современных технологий. У этого универсального подхода большое будущее: результаты исследований последних лет, в частности по направленному мутагенезу, позволяют рассчитывать на появление в скором времени эффективных лекарств для борьбы с заболеваниями, до сих пор считающихся неизлечимыми.

Перспективным направлением является развитие генных технологий.

1. Они способны существенно оптимизировать традиционную фармакотерапию (фармакогеномика).

2. Особые надежды возлагаются на генно-инженерные разработки препаратов для защиты от инфекционных болезней и патогенов.

Еще одно направление - биотехнологические препараты. Начинается конкуренция между традиционными синтетическими лекарственными средствами и биофармацевтическими препаратами. Становится привычным новый термин «биофармация».

В 2006 году объем мирового фармарынка составлял примерно 640 млрд. долл., при этом 10% уже приходилось на долю биотехнологических продуктов. Лидерами в области биофармации являются США и Германия.

Разработке современных биофармацевтических препаратов предшествовало освоение других биотехнологических методов, в частности ферментации бактерий и грибов, что позволило развить промышленное производство низкомолекулярных лекарственных средств, например антибиотиков, ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы (гидрокси-метилглутарил-коферментаА-редуктаза) и иммуносупрессоров. Биотехнологические лекарственные средства - это лекарственные препараты, предназначенные для профилактики, лечения или диагностики in vivo, которые развивают не фармакологическую, а биологическую активность. Они обладают рядом существенных отличий от химико-синтетических лекарственных средств. Действующее вещество биотехнологических препаратов имеет биологическое происхождение и является производным от живых клеток, обладает сложной гетерогенной молекулярной структурой. Исходным субстратом служат клетки животного происхождения или микроорганизмы (бактерии типа E.coli, дрожжи и пр.), используются их клеточные и субклеточные структуры.

Существенным отличием биотехнологических лекарственных средств является то, что в них используется естественная способность к метаболизму.

Для их получения производится изоляция и изменение геномной ДНК исходного продукта таким образом, что он получает новую, неспецифическую для данного вида способность к биосинтезу, которая и используется в лекарственных средствах. В первую очередь здесь следует назвать создание генномодифицированных организмов для получения рекомбинантных терапевтических протеинов. В настоящее время уже используется 115 лекарственных средств на основе 84 терапевтических протеинов. В 2006 г. в США в разработке находилось 418 биофармацевтических лекарственных средств, в Европе - 320. Часть из них уже проходят клинические исследования и скоро станут доступными врачам и их пациентам. По оптимистическим прогнозам, в 2015 г. половина инновационных лекарственных средств в мире будут основаны на протеинах или олигонуклеотидах. Следует также ожидать выхода на фармрынок новой категории лекарственных средств - биосимиляров - аналогов оригинальных биотехнологических лекарственных средств со сходной, но неидентичной активной молекулой. В ЕС в этом году зарегистрированы два первых биосимиляра (гормона роста - соматотропина). На регистрации в European Medicines Agency находятся порядка 12 биосимиляров (эритропоэтин и др.). Ожидается, что введение в медицинскую практику биосимиляров резко снизит затраты здравоохранения на биотехнологические лекарственные средства, сделает их доступными для широких слоев населения. В руках у врачей окажутся еще более эффективные препараты для борьбы с серьезными заболеваниями, многие из которых раньше считались неизлечимыми.

04.07.2013 - 31.12.2013

Проведен систематический анализ современной литературы по теме исследования. Установлены последовательности наиболее перспективных, с точки зрения исполнителей проекта, производных олигонуклеотидов и их аналогов, которые должны проявлять противовирусную и антибактериальную активности.
Разработаны методики синтеза модифицированных олигонуклеотидов и их конъюгатов с использованием автоматических ДНК/РНК-синтезаторов или в режиме неавтоматизированного синтеза на твердотельном носителе. Для дизайна олигонуклеотидных производных с заданной функциональностью предложены различные подходы, в том числе, основанные на прогностическом анализе структуры и стабильности формируемых дуплексов с помощью метода молекулярной динамики. Предложен способ синтеза новых, ранее не описанных производных олигонуклеотидов, несущих модификации по атому фосфора межнуклеотидной фосфодиэфирной группировки.
Разработана методика анализа эффективности проникновения флуоресцеин-меченных соединений в бактериальные клетки. Показано, что положительно заряженные производные пептида Flu-(LR)4G-амида эффективно проникают и накапливаются в Pseudomonas aeruginosa, а эффективность проникновения в нее олигонуклеотидов без транспортного пептида низка.
Все разработанные при выполнении исследований методики, как синтетические, так и аналитические, внедрены в работу Лаборатории Биомедицинской Химии ИХБФМ СО РАН. Полученные теоретические наработки использованы в образовательных курсах.
Созданная в лаборатории синтетическая база для получения, выделения и характеризации олигонуклеотидов является уникальной для РФ и близка к уровню лучших мировых научно-исследовательских лабораторий соответствующей специализации. Привлечение специалистов биологического профиля делает лабораторию уникальной по потенциалу ее научно-исследовательской реализации в направлении разработки РНК-направленных противовирусных и антибактериальных препаратов.

Развернуть

01.01.2014 - 31.12.2014

i) Оценка антибактериальной активности аналогов олигонуклеотидов/олигонуклеотидных конъюгатов по отношению к Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus;
ii) Оценка антивирусной активности аналогов олигонуклеотидов/олигонуклеотидных конъюгатов по отношению к вируса гриппа WSN33/A/H1N1.
iii) Выбор последовательностей олигонуклеотидных аналогов- лидеров, проявляющих антибактериальную или противовирусную активность на требуемом уровне;
iv) Разработка протоколов синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих группы, которые увеличивают эффективность их накопления в эукариотических или бактериальных клетках
iv) Оценка эффективности проникновения и накопления разработанных соединений в бактериальных и эукариотических клетках.
v) Подготовленная лаборатория;
vi) Статьи в научной периодике, индексируемой в Web of Science.
vii) Тезисы докладов на конференциях;
viii) Свидетельства об участии в в образовательных курсах;
ix) Конференция;

Развернуть

01.01.2015 - 31.12.2015

3.1 Антибактериальная активность соединений, содержащих последовательности-лидеры по отношению к Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus in vitro (в клеточной культуре);
3.2 Противовирусная активность соединений, содержащих последовательности-лидеры, по отношению к вирусу гриппа in vitro;

3.3. Технологические и терапевтические характеристики отобранных олигонуклеотидных аналогов и конъюгатов с учетом путей коммерциализации препаратов, в том числе:

3.3.1 Список стандартизованных экспериментальных методик для оценки антибактериальной и противовирусной активности препаратов олигонуклеотидных аналогов in vitro (в культуре клеток) и in vivo (на животных моделях);

3.3.3 Отобранные олигонуклеотидные аналоги и конъюгаты, которые наряду с проявлением высокой антибактериальной и противовирусной активности способны к эффективному проникновению и накоплению в клетках, в том числе:

3.3.2.1 Данные по проникновению в клетки и доставки модифицированных олигонуклеотидных аналогов и конъюгатов;
3.3.2.2 Оптимизированный полупрепаративный синтез, пре- и пост-синтетические модификации, выделение и количественный контроль олигонуклеотидных аналогов, проявляющих антибактериальную и противовирусную активность;
3.3.2.3. Оценка разработанных соединений с антибактериальной и противовирусной активностью с точки зрения коммерческого использования.

3.4 Подготовленный финальный отчет по Проекту;
3.5 Подготовленная лаборатория;

3.6 Тезисы докладов на конференциях;
3.7 Свидетельства об участии в в образовательных курсах;

3.8 3статьи в научной периодике, индексируемой в Web of Science

«Антисмысловая» РНК (Antisense RNA), которую предполагает­ся использовать в качестве лекарственного сред­ства, представляет собой короткий (15-20-нуклеотидов) олигонуклеотид, который может связываться с комплементарным ей определенным участком мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка, подавляя тем самым патологический процесс (рис.2).

Терапевтический эффект синтетических «анти­смысловых» олигонуклео-тидов зависит от спе­цифичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к дейст­вию клеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку. 15-20-нуклеотидные последо­вательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тес­тированием набора «антисмысловых» олигону­клеотидов с использованием культуры клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Для этого про­водят электрофоретическое разделение клеточ­ных белков, в которые включают радиоактив­ную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутст­вии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5"- или 3"-концам мРНК, границам экзонов и интронов и даже двухцепочечным областям. Антисмысловые олигонуклеотиды могут разрушаться внутрикле­точными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утра­тили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определен­ным образом пиримидиновые основания, рибозу или дезоксирибозу (рис.3). Так, у наиболее ши­роко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на группу SH (рис. 3Б), в результате чего образу­ется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщеп­ляются под действием эндонуклеаз. При гиб­ридизации с сайтом-мишенью они образуют дуплексы, которые активируют рибонуклеазу (РНКазу), эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в такой гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания та­ких олигонуклеотидов - лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефици­та человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний.

Синтезированы «антисмысловые» олигонук­леотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями - пептидные нуклеиновые кислоты (Peptide nucleicacids, PNAs) (рис.3В и Г ). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2"-угле­родному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысло­вые» олигонуклеотиды и облегчают их связыва­ние с сайтом-мишенью (рис. 32Д и Е ). Все преимущества этих и других модификаций сей­час интенсивно изучаются.

Проникновение «антисмыловых» олигонук­леотидов в клетку можно значительно облег­чить, поместив их в липосомы. Такая высокоэффективная система доставки позволяет ис­пользовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с антителами, специфичными к эпитопам определенных клеток тех или иных органов, то можно будет осуществлять адресную доставку «антисмысловых» олигонуклеотидов.

Проведенные доклинические испытания оказали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекартвенными средствами. Изучена возможность их применения для лечения стеноза коронарых и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через 6 месяцев вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрецию межклеточного вещества во внутренний слой артерии в месте ее расширения. В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного циклa млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток про­исходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования. Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами.

«Антисмыловые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты I фазы клини­ческих испытаний лечения болезни Крона с по­мощью орального введения «антисмыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко вы­раженный терапевтический эффект без замет­ных побочных эффектов. В этом случае мРНК-мишень кодировала межклеточный адгезии типа 1, который вырабатывается в избытке у па­циентов с болезнью Крона. Предполагается ис­следовать эффективность этого же олигонукле­отида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревматоидного артрита, псориаза и язвенного колита.

В принципе «антисмысловые» олигонуклео­тиды могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мишенью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклеотидов не соответст­вует стандартам, принятым для лекарственных средств.